GFP唾液乳杆菌CCFM6105的构建_高彤.pdf

：唾液乳杆菌 的构建高 彤 李明桂 梁水明 范丽佳 王长丽右江民族医学院临床医学院 广西百色；右江民族医学院基础医学院 广西百色 摘 要：目的：构建、筛选并鉴定出重组 唾液乳杆菌。方法：利用 作为报告基因，从携带 质粒的大肠杆菌中提取质粒，将 质粒电转化至唾液乳杆菌 中，构建 唾液乳杆菌。结果：产物电泳结果显示约在 处出现明亮条带，反应成功；在 电压下的菌落荧光暗沉；在 电压下的菌落荧光致密明亮；在、电压下菌落荧光偏暗；各代重组菌的 表达良好且无明显减弱。结论：本实验成功构建 唾液乳杆菌 且 在唾液乳杆菌在稳定遗传中得到了稳定的表达。关键词：唾液乳杆菌；绿色荧光蛋白；电转化 ，；，：，：，：，；：，：；乳酸杆菌（，）是一类能利用糖类产生乳酸的细菌，且可与人或兽在体内长期共存的一种微生物，其对肠道上皮细胞具有很强的黏附力，具有促进机体体液和细胞免疫、调节肠道菌群、维持菌群微生态平衡的作用。乳酸菌作为可食用益生菌，它的益生功能与其能否通过口服进入动物体内及运动分布情况密不可分。目前，对乳酸杆菌的研究主要集中在宿主生理和微生物菌群变化上，尚缺乏对菌株进入肠道后分布、运动及其定植的系统的针对性研究。细菌质粒是基因工程中最常用的载体，它可以将目标基因携带到受体细胞中，促进目标基因在受体中的表达。绿色荧光蛋白（，简称）是一种实验中常用的报告基因，分子量通常较小。因其能与多种蛋白质端结合且不破坏原始蛋白、细胞上可稳定表达、荧光强且易于检测等一系列优良特性，故 是一种理想实验观察效果极佳的荧光标记物。国内已有大量研究学者对 进行广泛且多维度的实验室应用：萨初拉等采用 作为报告基因为构建植物乳杆菌高效特异表达载体；方来杉等利用 作为标识研究乳杆菌在疫苗制备的用途等相关领域的研究，在 的标识下均取得了不错的实验观察效果。因此，本研究将经过 基因修饰的质粒利用电转化法转入 中，构建 唾液乳杆菌，为研究唾液乳杆菌定植、动态监测和口服免疫机制奠定基础。材料与方法 试验菌种、主要试剂、培养基和仪器唾液乳杆菌（）、携带 质粒且具有卡那霉素抗性的大肠杆菌、柱式质粒 小量抽提试剂盒、液、卡那霉素、限制性核酸内切酶（和 ）、蔗糖、甘油、培养基、培养基、培养基。电转化杯（规格理论研究科技风 年 月）、购自 公司的电穿孔仪、型生化培养箱、恒温培养箱和水浴锅、冰盒、型光学显微镜、仪、型台式离心机、共聚焦显微镜。携带 质粒的大肠杆菌的活化和复壮取携带在冰箱中 质粒的大肠杆菌甘油管（菌液 甘油 ）进行活化和复壮，取复壮后菌液于超净工作台内转接至 培养基，、震荡培养至对数生长期。取 原始菌液，对试管依次标记：试管，稀释浓度：、。取 稀释后菌悬液涂布在含 培养皿（每个梯度 个），恒温过夜培养。后，挑选培养基内长势较好菌落数在 范围内的进行传代培养。提取大肠杆菌的 质粒添加 培养基培养过夜，取 状态下的大肠杆菌菌液提取质粒备用。试剂盒提取质粒 作为模板，和 为引物进行扩增，具体扩增程序参照杨明阳、张莹等实验内容，应用电泳检测扩增产物。设计引物、扩增 基因片段、测序鉴定：登录 中查询 基因（）的开放阅读框架（）序列信息，分析（图）选取存在 质粒上启动子后限制性核酸内切酶（和 ），酶切位点插入引物两端，添加保护序列。应用 设计 对特异性引物进行验证：图 大肠杆菌 质粒结构图 唾液乳杆菌感受态细胞的制备及电转化实验感受态细胞的制备详细参照方来杉、张莹等实验，电转化实验在其他条件不变的情况下电压设置四个梯度（），确定唾液乳杆菌最适的转化电压。电转化对阳性转化子（在荧光显微观察有荧光的菌落则为阳性）进行计数，计算出四个电压梯度下的转化效率并分析。检测构建的 唾液乳杆菌的纯化度与稳定度通过稀释法把菌液用 进行稀释，取、稀释度的菌液少许均匀涂在有抗体的 平板上。在厌氧条件下培养 ，观察并挑选长势良好的转化子继续培养 代，纯化筛选出稳定表达绿色荧光的唾液乳杆菌。结果 质粒的大肠杆菌的活化与复壮结果连续传代结果表明：大肠杆菌从第 代培养基的生长速度稍慢，需要 才能生长出明显的菌落。随着菌株继代培养，生长速度显著加快，第 代后约 可见清晰的菌落。挑选生长良好的 质粒大肠杆菌进行液体震荡培养，随着时间的增长，通过图 可以看出，培养基中菌落的生长规律表现为先上升后趋于平稳，当 值 时，出现一个生长期，缓慢增加；当 值 时，呈对数期快速增长，值 后增长速度逐渐达到平稳期，菌落的活性逐渐恢复。图 大肠杆菌增长曲线 在大肠杆菌中 基因的遗传与表达情况如图 所示，可在共聚焦显微镜下观察到携带 质粒的大肠杆菌活化后的 能够稳定表达，表明大肠杆菌的活性得到很好的恢复。图 代大肠杆菌的 表达情况（）基因的扩增结果如图 所示，反应中出现了双酶切质粒、扩增验证 条带、另有一条清晰条带在约 处、一条约 处。处出现与预期片段大小一致的明亮条带，说明 反应成功，测定 产物与 载体的结果与 中 序列达。科技风 年 月理论研究图 电泳检测 产物的结果 唾液乳杆菌的电转化结果图 所示，唾液乳杆菌在其他条件不变的情况下，在 电压下的菌落荧光暗沉；在 电压下的菌落荧光致密明亮；在、电压下菌落荧光偏暗。由图 可看出，故电转化效率在 时最高，表明该电压为本实验电转化实验的四个电压中最适转化电压。图 在四个梯度下的条件下转化子的 基因表达情况图 唾液乳杆菌在四种不同电压下电转化效率 转化子的荧光蛋白表达情况把 代的转化子液体震荡培养，取 的菌液稀释 倍，将稀释后的菌液滴在 个玻片上进行荧光检测，把每个在显微镜下玻片的视野均等划分为 块，每个视野随机取 块，计算 块视野的取样平均值绘图（图）比较发现，代转化子在共聚焦显微镜下 表达良好，表明在菌株的繁衍过程中 的表达未出现明显的渐弱或丢失，工程菌株构建成功。图 代转化子荧光表达结果统计表 讨论唾液乳杆菌是一种细胞壁较厚的革兰氏阳性菌，外源 转移到唾液乳杆菌的效率低下。利用电转化法可以提高外源 转移到唾液乳杆菌细胞转化效率，并且相对稳定。细胞膜表面在电击时会形成临时孔隙，外来分子可经孔隙进入受体细胞，若电压过低，在细胞膜上难以形成适配的孔隙，外来分子难以转入；电压过高，细胞膜上形成的孔隙因增大而造成细胞膜通透性增加，外来分子更易进入细胞；而超过细胞的承受力的电压则直接导致细胞破裂死亡，所以适当的电压刺激至关重要。目前，大多数实验者使用 到 的电压，唾液乳杆菌一般在 电压下，可以取得较好的转化率。近年来，通过优化电转化方法，各类细菌的电转化所需电压存在明显差异。韦云莹等利用响应面法优化发酵乳杆菌的电转化条件，其中电压强度为 ；在 时，乳酸乳球菌 的电转化效率达到最佳。乳酸菌种类繁多，有研究发现在同样的参数下，不同乳酸菌的最佳电转化效率亦不尽相同，譬如唾液乳杆菌 与 相比，转化效率差异明显，不同菌种的转化能力差异或与菌株的特异性有关；同时乳酸菌的电转化效率亦受质粒浓度的影响，在一定浓度范围内质粒浓度提高，电转化效率亦相对应地提高，当转化效率超过一定范围后会有不同程度的降低。综上，乳杆菌的电转化需要依据具体的菌株设立有效的转化方法，除上述因素外，影响电转化效率的因素还包括细菌的生理状态、复苏时间、质粒大小等。本研究构建出了携带 基因的唾液乳杆菌，结果表明重组的菌株在遗传 代仍能稳定表达，但重组菌进入机体后是否会影响细菌本身的复制以及 的表达都还未可知，有待深入实验考究。参考文献：陈彩玲，毛丙永，崔树茂，等绿色荧光蛋白标记植物乳杆菌及其生物学特性的研究食品与发酵工业，（）：王乐乐，闻艳丽，李兰英，等质粒 构型分离和分析方法研究进展化学试剂，（）：杨晓玫，姚拓，师尚礼荧光蛋白标记研究进展草业学报，（）：萨初拉，吴青海，白苏乐，等利用绿色荧光蛋白报告基因筛选植物乳杆菌强启动子畜牧与饲料科学，（）：方来杉，赖强，钟泽民，等植物乳杆菌内源性质粒序列分析及其表达载体的构建食品科学，（）：杨明阳，田建军，赵丽华，等基于 与平板理论研究科技风 年 月计数法对比分析发酵香肠发酵过程中的乳酸菌数中国食品学报，（）：张莹，宋馨，夏永军，艾连中，等 基于 系统对干酪乳杆菌进行红色荧光蛋白标记工业微生物，（）：王巧惠，王光强，宋馨，等不同质粒电转三种乳酸菌的比较研究工业微生物，（）：张晓宇，王慧，杨昳津，等唾液乳杆菌电转化效率优化研究工业微生物，（）：郭鑫，王莎莎，李晨，等基于原生质体法保加利亚乳杆菌电转化条件的研究中国食品学报，（）：曹博唾液乳杆菌在动物体内定植规律研究及阴道微生态状况分析黑龙江大学，韦云莹，赵燕，庄金伟，等利用响应面法优化发酵乳杆菌 电转化条件食品与发酵工业，（）：韦云莹，王立峰，熊智强，等响应面法优化乳酸乳球菌电转化效率研究上海理工大学学报，（）：基金项目：广西高校中青年教师基础能力提升项目（）；自治区教育厅 年和 年创新创业训练计划项目（、）；右江民族医学院 年度校级科研课题（）；年右江民族医学院“新启航”青年骨干项目作者简介：高彤（），女，广西桂林人，本科在读，研究方向：临床医学。通讯作者：王长丽（），女，广西南宁人，研究生，讲师，研究方向：基础医学、微生物资源挖掘与利用。（上接第 页）达工程班的学员认为知识点能够融会贯通，便于消化、吸收、巩固，而电子对抗工程班的学员则认为知识多且乱，记忆内容较多，感到混乱，复习时无从下手。可见成功的章节小节能够帮助学员理解并进一步掌握所学的基本知识、基本理论和基本方法，为达到融会贯通和应用自如的效果起到了重要的作用。结语文章结合教学对象和教学内容的不同，采取三种不同形式的微波技术章节小结方法并给出应用实例，规则波导和空腔谐振器采用的是知识结构框图法，无源微波器件采用的是列表分析法，微波传输线中工作参量之间的关系采用的是点面归纳法。三种方法各有千秋，与传统的章节小结相比，它们不仅帮助学员形成脉络清晰的微波技术知识体系，易于掌握、便于记忆、利于复习，提高了学习效率，而且培养了学员的发散思维和综合思维能力，在实际的教学应用中，取得了较好的效果，是一种非常有效的教学方法。参考文献：陈晓莉谈谈小学数学课堂小结的几种方法和作用数学教学通讯（初等教育），（）：袁才先，袁水波数学课堂教学小结的方式及作用中学教师，（）：包燕丽“梳”则通，“理”则顺教学月刊小学版，（）：基金项目：面向超表面隐身目标探测的 涡旋波散射特性研究（编号）作者简介：贺昌辉（），女，工学硕士，副教授，主要从事电磁场与微波技术的教学和研究工作。（上接第 页）论知识，让同学们认识到“线性代数”课程应用广泛，引导学生积极思考，激发学生学习的主动性，同时将知识传授和立德树人有机结合起来，实现全方位育人。参考文献：，吴赣昌线性代数（理工类第五版）中国人民大学出版社，冯霜，温永川，李金权案例教学在金融数学专业基础课中的应用 以求解齐次线性方程组的教学为例科技风，（）：基金项目：年度中央民族大学校级教学改革立项项目“线性代数（工科民族实验班）”作者简介：杨慧（），女，汉族，山东枣庄人，博士，中央民族大学理学院副教授，主要从事随机过程研究。科技风 年 月理论研究