FGF21过表达抑制胰腺癌...、迁移和侵袭并促进细胞凋亡_马世玲.pdf

宁夏医科大学学报45卷收稿日期：2022-10-28基金项目：国家自然科学基金项目（81860434）；宁夏自然科学基金项目（2021A0647）作者简介：马世玲（1994），女，在读硕士研究生，研究方向：胰腺癌。E-mail：通信作者：黄李雅（1974），女，教授，博士研究生导师，主要从事消化内科临床及研究工作。胰腺癌是一种致命的恶性肿瘤，主要起源于胰腺导管上皮，是导致癌症相关死亡的原因之一1。胰腺癌起病隐匿，约 80%的患者在明确诊断时已经失去手术机会。晚期患者行化疗、放射治疗或其他综合治疗效果有限，即使近年来兴起的肿瘤免疫疗法，也因肿瘤细胞表面缺乏免疫原性及其独特的肿瘤微环境存在很大的挑战和窘境2。成纤维细胞生长因子（fibroblase growth factors，FGFs）由 23 个成员组成，人类 FGF 信号转导涉及发育、肿瘤、代谢和神经疾病3。成纤维细胞生长因子 21（FGF21）被认为是一种重要的内分泌代谢调节因子，主要在肝脏、胰腺和脂肪中表达，此外，在肾脏中也有所表达4。研究5表明，FGF21 在肿瘤发生发展中也具有潜在调节作用。目前，FGF21 在胰腺癌的发生和发展中的具体作用机制尚不清楚。为探究 FGF21 对胰腺癌细胞表型的影响，本研究将 FGF21 过表达技术应用于胰腺癌细胞 PANC-1，观察 FGF21 对胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和细胞凋亡的影响，以阐释 FGF21 抑制胰腺癌细胞发展机制，以期为胰腺癌寻找新的有效靶向治疗位点提供理论依据。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞株及重组慢病毒载体人胰腺癌细胞株 PANC-1 购自中国科学院（上海）细胞库。在宁夏医科大学总医院干细胞实验室培养。含过表达 FGF21 基因序列的重组慢病毒载体 HBLV-h-FGF21-3xflag-ZsGreen-PURO 及慢病毒空载体 HBLV-ZsGreen-PURO 购自汉恒生物科技（上海）有限公司。1.1.2 主要试剂DMEM 高糖培养液和胎牛血清购自美国 Gibco 公司；兔抗人 FGF21 单克隆抗体、兔抗人 Cleaved-caspase3 单克隆抗体、兔抗人Caspase3 单克隆抗体、兔抗人 Caspase9 单克隆抗体均购自美国 Abcam 公司；GAPDH、Tublin 购自美国 Proteintech 公司；ECL 试剂盒购自江苏凯基生物技术有限公司；引物购自上海生工生物工程有限公司；RNA 反转录试剂盒、荧光定量 PCR 试剂盒和 CCK-8 试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；流式凋亡试剂盒购自上海伟进生物科FGF21 过表达抑制胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭并促进细胞凋亡马世玲1，黄李雅2（1.宁夏医科大学，银川750004；2.宁夏医科大学总医院，银川750004）摘要：目的探讨成纤维细胞生长因子 21（FGF21）基因过表达对人胰腺癌细胞株 PANC-1 凋亡、增殖、迁移和侵袭的影响。方法将含 FGF21 基因序列的重组慢病毒载体 FGF21-3xflag-ZsGreen-PURO 和空载体HBLV-ZsGreen-PURO 感染人胰腺癌 PANC-1 细胞，采用 Western blot 和 RT-qPCR 检测过表达 FGF21 的PANC-1 细胞中 FGF21、Caspase3、Cleaved-caspase3、Caspase9 蛋白和 FGF21、肿癌坏死因子-（TNF-）、白细胞介素-6（IL-6）的 mRNA 表达，流式细胞仪检测过表达 FGF21 的 PANC-1 细胞的凋亡，CCK-8 法检测其增殖能力，划痕愈合实验和 Transwell 实验检测其迁移和侵袭能力。结果HBLV-h-FGF21-3xflag-ZsGreen-PURO转染人胰腺癌细胞株 PANC-1 后，FGF21 蛋白表达水平较空载体感染组升高，凋亡蛋白 Caspase3、Cleaved-caspase3、Caspase9 蛋白的表达水平均升高（P 均0.01）；FGF21 的 mRNA 表达水平较空载体感染组升高，且TNF-和 IL-6 的 mRNA 表达水平降低（P 均0.01）；FGF21 过表达后可增加吉西他滨诱导的胰腺癌细胞株PANC-1 凋亡率，增殖、迁移和侵袭能力均降低（P 均0.01）。结论FGF21 可抑制胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭并促进细胞凋亡。关键词：胰腺癌；转染；慢病毒；成纤维细胞生长因子 21中图分类号：R735.9文献标识码：ADOI：10.16050/ki.issn1674-6309.2023.03.006文章编号：1674-6309（2023）03-0250-08论著第 45 卷3 期2023 年 3 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University2503期技有限公司；吉西他滨购自上海源叶生物科技有限公司。1.2方法1.2.1细胞培养及重组慢病毒感染人胰腺癌细胞株 PANC-1 用含 10%胎牛血清的 DMEM 培养液，置于 37、5%CO2的培养箱中进行培养。取对数生长期的 PANC-1 细胞，以 1.5105个/孔接种于 6 孔培养板中，细胞融合度达到 70%时，依据病毒的感染复数（multiplicity of infection，MOI）为 5，分别加入重组慢病毒载体 HBLV-h-FGF21-3xflag-ZsGreen-PURO 和空载体 HBLV-ZsGreen-PURO 进行病毒感染。72 h 后用荧光显微镜（放大倍数为 100）观察病毒感染效率，用含嘌呤霉素抗性的培养液筛选获得 FGF21 过表达的稳定感染细胞株，命名为 PANC-1/FGF21 OE 细胞（OE 组）；感染空病毒载体 HBLV-ZsGreen-PURO的 PANC-1 细胞命名为 PANC-1/FGF21 OC 细胞（OC 组）和空白细胞组。1.2.2Western blot 检测 FGF21 过表达 PANC-1细胞中 FGF21 及凋亡相关蛋白的表达分别收集病毒感染、培养 72 h 后的空白细胞组、OC 组和 OE 组细胞培养液，用冷丙酮沉淀，离心（14 000g）10 min，PBS 重悬，Loading Buffer 加热（100）变性 5 min。蛋白经还原 SDS-PAGE 处理，转移至 PVDF 膜上，用含 5%脱脂奶粉的封闭液室温封闭 2 h；加入一抗（兔单克隆抗体FGF21 11 000 稀释）4 过夜；TBST 洗膜 3 次，每次 10 min，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG（15 000），室温反应 1 h；TBST 洗膜 3次，每次 15 min，用 ECL 试剂盒曝光显影。以 OE组与 OC 组蛋白条带的灰度值之比，以及 OE 组与空白细胞组蛋白条带的灰度值之比表示 OE组蛋白的相对表达水平。分别收集病毒感染 72 h 后的 OE 和 OC 组以及空白细胞组细胞，用全蛋白提取试剂盒分别提取各组细胞的总蛋白，Loading Buffer 加热变性（5 min 100），取蛋白质 20 g/孔，经还原SDS-PAGE 处理，转移至 PVDF 膜上，用含 5%脱脂奶粉的封闭液室温封闭 2 h；加入一抗（兔单克隆抗体 Caspase3 15 000 稀释；兔单克隆抗体 Cleaved-caspase3 11 000 稀释；兔单克隆抗体Caspase9 11 000）；GAPDH 11 000 稀释；Tublin（11 000）4 过夜；TBST 洗膜 3 次，每次 10 min，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG（15000），室温反应 1 h；TBST 洗膜 3 次，每次 15 min，用ECL 试剂盒曝光显影。以目的蛋白与内参蛋白条带的灰度值之比表示目的蛋白的相对表达水平。1.2.3RT-qPCR 检测 FGF21 过表达 PANC-1 细胞中 FGF21、肿瘤坏死因子-（TNF-）、白细胞介素-6（IL-6）的 mRNA 表达应用 TRIzol 提取细胞总 RNA 后，从总 RNA 中反转录 cDNA，利用PrimeScript RT Master Mix Perfect Real-Time 试剂盒从总 RNA 中反转录 cDNA。mRNA 表达用SYBRTMGreen PCR Master Mix 和 7300 Real-TimePCR 系统，反应容积 20 L，热循环程序为：95 1 min；95 15 s，60 30 s，72 30 s 进行 40个循环。定量 mRNA 的相对表达量。获取 Ct 值，以-actin 作为内参对照，应用 2-Ct值计算FGF21、TNF-、IL-6 的 mRNA 相对表达量Ct=（过表达组样品的目的基因的 Ct 平均值-内参基因的 Ct 平均值）-（对照组样品的目的基因的 Ct平均值-内参基因的 Ct 平均值）。PCR 引物由上海生物工程有限公司合成。FGF21正义引物5-GAAGCCGGGAGTTATTCAAATC-3；FGF21 反义引物 5-ACATTGTATCCGTCCTCAAGAA-3；TNF-正义引物 5-AGCCCTGGTATGAGCCCATCTATC-3；TNF-反义引物 5-TCCCAAAGTAGACCTGCCCAGAC-3；IL-6正 义 引物5-CACTGGTCTTTTGGAGTTTGAG-3；IL-6 反义引物 5-GGACTTTTGTACTCATCTGCAC-3。1.2.4CCK-8 法检测转染 后胰腺癌细 胞株PANC-1 细胞增殖能力各组细胞接种于 96 孔板中（5103个/孔），待细胞贴壁生长后，分别于0、24、48、72 h 加入 10 L CCK-8 溶液，37 培养箱内孵育 2 h，检测 450 nm 波长处各孔的 光密度（OD）值。分别进行 3 次独立实验，计算各组细胞增殖率（%）=（24、48、72 h 时增殖 OD 值-0 h时增殖 OD 值）/（0 h 时增殖 OD 值）100%。1.2.5划痕愈合实验和 Transwell 小室实验检测FGF21 过表达 PANC-1 细胞的迁移和侵袭能力将各组 PANC-1 细胞接种于 6 孔板中（1.0106个/孔），细胞生长至融合度近 100%时，用无菌的 200 L 移液器枪头在细胞层均匀划线，低血清培养液继续培养。分别于划痕的 0 h和 48 h，光学显微镜（放大倍数为 40）下拍照、测马世玲，等.FGF21过表达抑制胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭并促进细胞凋亡251宁夏医科大学学报45卷定划痕面积。划痕愈合率（%）（0 h 划痕面积48 h 划痕面积）/0 h 划痕面积 100%。24 孔 Transwell 小室（孔径为 8 m）的上室中铺入 90 L 基质胶（体积稀释比例为 12），37 培养箱内过夜使之凝固。将各组 PANC-1 细胞用无血清培养液重悬后，接种于上室中（1105个/孔），下室中加入含 20%胎牛血清的培养液；24 h 后取出上室，PBS 清洗 2 次，用 4%多聚甲醛溶液固定细胞 30 min，甲醇通透细胞 20 min，结晶紫染色 25 min，PBS 清洗后，用棉签擦拭各小室内没有迁移的细胞，光学显微镜下随机取 3个视野（放大倍数为 200），观察每个小室的穿膜细胞并计数。1.2.6流式细胞仪检测 FGF21 对吉西他滨诱导胰腺癌细胞株 PANC-1 凋亡的影响各组细胞接种于 12 孔板中（1106个/孔），待细胞贴壁生长后分别给予空白细胞组、OC 组和 OE 组最终浓度为 80 g mL-1的吉西他滨，实验设置 3 个平行对照组（空白组、PE 组、7 AAD 组），培养48h后，收集 1105个细胞，加入 5 L PE 和 7 AAD避光染色 15 min 后上流式细胞仪检测，分析凋亡率。1.3统计学方法采用 SPSS 20.0 统计学软件进行数据分析。所有实验均独立进行 3 次重复，计量资料以均数标准差（xs）表示，组间比