多浪羊PRLR基因克隆测序及不同组织差异表达分析_李孝君.pdf

第 41 卷 第 2 期2023 年 4 月四川农业大学学报Journal of Sichuan Agricultural UniversityVol.41 No.2Apr.2023多浪羊PRLR基因克隆测序及不同组织差异表达分析李孝君1，2，隋志远1，2，王晨光1，2，张永杰1，2，张志帅1，2，邢凤1，2*（1.塔里木大学动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300；2.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）摘要：【目的】克隆多浪羊催乳素受体基因（PRLR）CDS区序列，并检测不同组织中PRLR基因在初情期前后表达差异，为PRLR基因在初情期启动过程中发挥的主要作用提供参考依据。【方法】利用RT-PCR技术和使用相关的生物学信息软件预测其编码蛋白的结构和功能，通过qPCR检测多浪羊初情期前后各组织中的PRLR基因的表达水平。【结果】获得了多浪羊PRLR基因的CDs区序列长1 746 bp。多浪羊的3个时期5个组织中均有PRLR基因的表达。PRLR基因在初情期前多浪羊垂体组织中的表达量显著高于其他组织（P0.05）；初情期垂体组织中PRLR基因的表达量仍显著高于其他4个组织（P0.05），初情期后下丘脑和垂体组织中PRLR基因的表达量显著高于其他3个组织（P0.05）；初情期垂体和输卵管组织中PRLR基因的表达量升高，初情期后显著高于初情期前和初情期后（P0.05）。【结论】揭示了PRLR基因可能在多浪羊初情期启动的过程中参与了调控。关键词：多浪羊；PRLR；初情期；克隆；生物信息学分析中图分类号：S826.2 文献标志码：A 文章编号：1000-2650（2023）02-0344-08Cloning Sequencing of PRLR Gene and Differential Expression Analysis of Different TissuesLI Xiaojun1，2，SUI Zhiyuan1，2，WANG Chenguang1，2，ZHANG Yongjie1，2，ZHANG Zhishuai1，2，XING Feng 1，2*（1.College of Animal Science，Tarim University，Aral 843300，Xinjiang，China；2.Tarim Animal Husbandry，Xinjiang Production and Construction Corps Point Laboratory，Aral 843300，Xinjiang，China）Abstract:【Objective】This study was conducted to clone the CDS sequence of prolactin receptor gene（PRLR）of Duolang sheep and detect the expression difference of PRLR gene before and after the initial estrus in different tissues，so as to provide reference for the main role of PRLR gene in the initiation of the initial estrus.【Method】RT-PCR technology and relevant biological information software were used to predict the structure and function of the encoded protein，and qPCR was used to detect the expression level of PRLR gene in each tissue of Duolang sheep before and after the first estrus stage.【Result】The CDs sequence of PRLR gene of Duolang sheep was 1 746 bp in length.PRLR gene was expressed in all five tissues of Duolang sheep at three stages.The expression level of PRLR gene in pituitary tissues of Duolang sheep before estrus was significantly higher than that in other tissues（P0.05）.The expression level of PRLR gene in pituitary tissues was still significantly higher than that in the other four tissues（P0.05），and the expression level of PRLR gene in hypothalamus and pituitary tissues was significantly higher than that in the other three tissues after the initial estrus（P0.05）.The expression of PRLR gene was increased in pituitary and oviduct tissues during the initial estrus period，and was significantly higher after the initial estrus period than before and after the initial estrus period（P0.05）.【Conclusion】These results suggest that PRLR gene may be involved in the regulation of estrus initiation in Duolang sheep.doi：10.16036/j.issn.1000-2650.202210176收稿日期：2022-10-06基金项目：国家自然科学基金项目（31660652；31960655）。作者简介：李孝君，硕士研究生。*责任作者：邢凤，博士，教授，主要从事动物遗传育种与繁殖研究，E-mail：。第 2 期李孝君，等：多浪羊PRLR基因克隆测序及不同组织差异表达分析Keywords:Duolang sheep；PRLR；puberty；cloning；bioinformatics analysis初情期是雌性动物初次发情并发生排卵获得生殖能力的时期，这一时期始于下丘脑内GnRH神经元分泌促性腺激素释放激素(GnRH)，这是由表达高水平跨膜催乳素受体的 Kisspeptin 神经元调节的。初情期的发生受生殖激素的调控，催乳素对黄体生成素和卵泡刺激素具有协调作用1。哺乳期间发现的血清PRL水平升高，或由慢性催乳素（PRL）输注引起，会降低促性腺激素和Kisspeptin的分泌，并影响动物的发情周期及排卵，而在试验中发现PRL有助于初情期的启动从而获得生殖能力2。PRL跟其受体（PRLR）作用于靶细胞，调节繁殖相关生殖激素的合成和分泌，PRLR基因的表达3,研究发现PRL结合其PRLR能产生不同的生理作用4。该基因变异对初情期年龄会产生影响5。PRLR基因首先在大鼠上被发现的，随后在小鼠上也被发现，学者们对其他动物的PRLR基因进行了克隆，如在猴、牛、羊、马、兔，鸡、鹅、羊驼、鱼和猪等动物也发现了PRLR基因。目前PRLR基因在绵羊、山羊、鸽子、乌龟、鸡、鸭、羊驼、小鼠和大鼠等动物的下丘脑、垂体、子宫、卵巢、输卵管和胎儿的一些细胞中均有表达，且不同时期的组织中的表达量存在差异6-9。多浪羊是新疆南疆的优良绵羊品种，具有发情早，生长速度快等优点。但国内并没有PRLR基因对绵羊初情期的影响的报道。因此，本试验为多浪羊垂体中PRLR基因克隆测序后，进行生物信息学分析和荧光定量PCR（qPCR）的方法，对多浪羊的PRLR基因的CDS序列分析以及测定初情期前后3个时期垂体、下丘脑、卵巢、子宫和输卵管各组织中的PRLR基因的表达差异，为研究PRLR基因功能和进一步说明PRLR基因在绵羊初情期的启动过程产生的影响提供依据。1材料和方法1.1材料1.1.1试验材料的采集试验动物是从南疆麦盖提多浪羊种羊繁殖羊场购买，同一饲养条件下的小母羊（2月龄）15只饲养于塔里木大学实验站，观察其发情特征，初情期前（90日龄），初情期（初次发情后的46 d），初情期后（发情10 d后)在无菌条件下用专门处理过的手术器械快速采集以上羊的下丘脑、垂体、子宫、卵巢和输卵管整个组织，其中同一年龄阶段的5个组织样本视为生物学重复，采集的组织用酒精消毒剪成 1 cm3大小的组织放入冻存管内，储存在液氮中，带回放入-80 的冷冻室备用。1.2试验试剂Trizol 购自Invitrogen；qPCR 试剂盒、反转录试剂盒和DH5感受态细胞从北京全式金生物技术有限公司进行购买；胶回收试剂盒和DNA Marker2000均在北京天根生化科技有限公司购买；蓝白斑试剂从北京索莱宝科技有限公司购买；PMD19-T购自大连宝生物工程有限公司。1.3提取RNA与cDNA合成使用 Trizol 法提取多浪羊各组织中的RNA，检测其浓度后计算后在同一浓度下（1 000 ng/L)使用反转录试剂盒进行cDNA合成,将得到的cDNA放到-20 的冷冻室备用。1.4引物设计及PRLR基因CDS区的克隆从GeneBank 上找到的Ovis areas PRLR mRNA登录号为；AF041257.1，根据 Primer Premier5.0 设计PRLR基因克隆的引物见表1。PCR反应体系为25 L：12.5 L 2EasyTaq PCR SuperMix，9.5 L ddH2O，上下引物各1 L，1 L cDNA。反应条件：95，3 min；95，30 s；58，30 s；72，1 min；重复35个循环；72，5 min；4 保存。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶检测后，使用胶回收试剂盒回收的 CDA 与PMD19-T载体连接，将连接好的载体于DH5感受态细胞混合不含氨苄青霉素的液体培养基，进行摇床复苏，条件为120 min，37，225 r/min。将含有大肠杆菌液接种在含有氨苄青霉素的固体培养基上，放置30 min，培养皿倒置在37 恒温培养箱过夜。挑出阳性重组子后进行PCR扩增，将合格菌液送至上海生工生物工程有限公司进行测序。利用测序获得的序列设计qPCR引物，以-actin为内参基因。上海生工生物工程公司合成引物。1.5实时荧光定量 PCR以多浪羊cDNA为模板，利用qPCR检测多浪羊各组织中PRLR的表达量。反应总体系为15 L：7.5 L 2Transtant qPCR Mix，5.5 L ddH2O，上下游引物各 0.5 L（10 nmol/L），1 L cDNA。反应条件：95，2 min；95，15 s；55，15 s；68，20 s，重复反应40次。345四川农业大学学报第 41 卷 1.6生物信息学分析用MEGA7.0软件对PRLR 蛋白系统发育分析图：ExPASy-PrortScale 和 ExPASy-ProtParam tool 在线 软 件 分 析 PRLR 蛋 白 质 理 化 性 质；利 用TMHMM2.0分析PRLR蛋白跨膜区域；利用NetPhos 3.1软件对PRLR蛋白进行磷酸化位点预测；SignalP 5.0预测蛋白质的信号肽；利用SOPMA在线软件预测蛋白二级结构；SWISS-MODEL软件