茶黄素（TF_1）对人肝癌...2细胞的抑制作用及机制研究_王专.pdf

茶叶科学 2023，43（2）：287296 Journal of Tea Science www.tea- 收稿日期：2022-07-26 修订日期：2022-11-18 基金项目：南宁市青秀区重点研发项目（2020023）、右江民族医学院高层次引进人才项目（YY2021sk02）、河南豫南茶叶综合利用重点实验室开放基金（HNKLTOF2018005）、福建省生态产业绿色技术重点实验室开放资金（WYKF2020-5）作者简介：王专，男，硕士研究生，主要从事食品营养学的研究。*通信作者： 茶黄素（TF1）对人肝癌 Bel-7402 细胞的 抑制作用及机制研究 王专1，韦武均2，任珍珍2，何志龙1，范玉纯3，周洁3，郭桂义4，蒋利和1,2,3*1.广西大学轻工与食品工程学院，广西 南宁 530004；2.右江民族医学院基础医学院，广西 百色 533000；3.广西大学医学院，广西 南宁 530004；4.信阳农林学院河南茶叶综合利用重点实验室，河南 信阳 464000 摘要：探究茶黄素（TF1）对人肝癌 Bel-7402 细胞的影响，并阐明其作用机制。通过 CCK-8 检测细胞活力，用平板克隆形成试验检测细胞增殖能力，细胞划痕愈合试验和 Transwell 小室法检测细胞迁移，用流式细胞术检测细胞凋亡，Western blot 检测细胞凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、PARP）、迁移相关蛋白（E-cad、N-cad、Vimentin、MMP9）和信号通路相关蛋白（TGF-、smad3、p-smad3）表达水平。结果表明，不同剂量 TF1均可抑制 Bel-7402 细胞的增殖和迁移，促进其凋亡，并且存在剂量依赖性，剂量越大，抑制作用越强（P0.05）。与对照组相比，试验组 Bax、E-cad 蛋白表达水平较高，Bcl-2、PARP，N-cad、Vimentin、MMP9、TGF-、smad3、p-smad3 表达水平较低（P0.05）。茶黄素可能通过 TGF-信号通路抑制肝癌 Bel-7402细胞的增殖、迁移，且促进其凋亡。关键词：茶黄素；人肝癌细胞；机制研究 中图分类号：S517.1；R735.2 文献标识码：A 文章编号：1000-369X（2023）02-287-10 Inhibitory Effect and Mechanism of Theaflavin(TF1)on Hepatoma Carcinoma Bel-7402 Cells WANG Zhuan1,WEI Wujun2,REN Zhenzhen2,HE Zhilong1,FAN Yuchun3,ZHOU Jie3,GUO Guiyi4,JIANG Lihe1,2,3*1.College of Light Industry and Food Engineering,Guangxi University,Nanning 530004,China;2.School of Basic Medical Sciences,Youjiang Medical University for Nationalities,Baise 533000,China;3.Medical College,Guangxi University,Nanning 530004,China;4.Henan Key Laboratory of Tea Comprehensive Utilization in South Henan Xinyang Agriculture and Forestry University,Xinyang 464000,China Abstract:To explore the inhibitory effect and mechanism of theaflavin(TF1),human hepatoma carcinoma Bel-7402 cells were treated with different concentrations of TF1.Cell viability was detected by CCK8 and cell proliferation was detected by colony formation assay.Cell migration was detected by cell wound healing experiment and transwell chamber assay.Cell apoptosis was detected by flow cytometry.Apoptosis-related proteins(Bax,Bcl-2,PARP),migration related proteins(E-cad,N-cad,Vimentin,MMP9)and signaling pathway related proteins(TGF-,Smad3,p-smad3)were detected by western blot.The results show that different concentrations of TF1 could inhibit the proliferation and migration of Bel-7402 cells and promote their apoptosis in a dose-dependent manner.The higher the dose,the stronger the inhibition effect(P0.05).Compared with the control group,the expression levels of Bax and E-cad proteins in the experimental group were higher,while the expression levels of Bcl-2,PARP,N-cad,DOI:10.13305/ki.jts.20230418.001288 茶 叶 科 学 43 卷 Vimentin,MMP9,TGF-,Smad3 and p-smad3 were lower(P0.05).In conclusion,TF1 could inhibit the proliferation and migration of Bel-7402 cells and promote their apoptosis through TGF-signaling pathway.Keywords:theaflavin,human hepatoma carcinoma cell,mechanism research 恶性肿瘤是医学研究领域的难题1，肝细胞癌（HCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一2。肝癌复发率和病死率高，已严重威胁着人类健康3。目前的治疗方案有手术切除、常规化疗等，但这些治疗方案有预后不良和耐药性等缺陷4-5。因此，识别具有潜在治疗效果的天然产物或新药物对治疗肝癌具有重要意义。茶黄素类物质于 1957 年被 Roberts6发现以来，迄今已在红茶中发现 25 种茶黄素组分，其中含量最多的是茶黄素（Theaflavin，TF1）、茶黄素-3-没食子酸酯（Theaflavin-3-gallate，TF2a）、茶黄素-3-没食子酸酯（Theaflavin-3-gallate，TF2b）和 茶 黄 素 双 没 食 子 酸 酯（Theaflavin-3,3-digallate，TF3）。茶黄素是红茶中的一种次生多酚，广泛存在于发酵茶中，具有抗菌、降脂、抗炎、抗突变和抗肿瘤作用，被认为是从茶中分离出来的“黄金分子”7。有研究报道，TF1对不同的肿瘤细胞具有抗肿瘤活性，包括乳腺癌8、前列腺癌9、肺癌10、结直肠癌11、卵巢癌12、宫颈癌13等。2006年，屠幼英等14报道了 TFs 对人肝癌 Bel-7402细胞的生长有抑制作用。然而，TF1是否能抑制 Bel-7402 细胞的迁移并促进其凋亡，其作用机制尚不清楚。因此，本研究将通过细胞试验，探讨 TF1在体外对 Bel-7402 增殖、迁移和凋亡的影响，旨在明确这些过程的相关机制，为 TF1抑制肝细胞癌的研究提供理论依据。1 材料与方法材料与方法 1.1 试验材料 TF1（纯度98%）购自成都普瑞法生物技术有限公司，CCK-8 试剂盒购自美国 MCE公司，E-cad、N-cad、Vimentin、MMP9、Bax、Bcl-2、-actin、PARP、TGF-1、smad3、p-smad3均购自 affinity 抗体公司，Trizol 购自日本TaKaRa 公司，流式凋亡试剂盒购自美国 ATT公司，Hoechst33258 购自上海碧云天生物技术有限公司。1.2 试验方法 1.2.1 细胞培养 人肝癌 Bel-7402 细胞和正常肝细胞 LO2购自中国科学院上海细胞所，在 RPMI 1640培养基中添加 10%胎牛血清、100 UmL-1青霉素和 100 mgmL-1链霉素在 37 恒温培养箱中培养。1.2.2 CCK-8 试验检测细胞活力 将人肝癌 Bel-7402 细胞和正常肝细胞 LO2以每孔 5104个细胞的密度接种于 96 孔板中，以浓度为 120 molL-1的顺铂作为阳性对照，用不同浓度（0、20、40、80、100、120 molL-1）的 TF1处理后，分别培养 24、48、72 h。然后每孔加入 CCK-8溶液 10 L，在 37 孵育 1 h。最后，在 450 nm 处测定吸光度，并计算细胞活力。细胞活力=（OD试验组/OD对照组）100%。1.2.3 流式细胞术和 Hoechst33258 检测细胞凋亡 将 Bel-7402 细胞接种于 6 孔板（每孔5104个细胞）中，培养过夜。用不同浓度（0、50、100 molL-1和 150 molL-1）的 TF1处理24 h，使用不含 EDTA 的胰蛋白酶收集细胞，然后用AnnexinV/PI细胞凋亡检测试剂盒按照说明书进行细胞染色，用流式细胞仪检测。Hoechst33258 染色则是将细胞用不同浓度（0、50、100 molL-1和 150 molL-1）TF1处理 24 h后，弃废液，用 4%细胞固定液固定 20 min，使用 Hoechst33258 染色 1520 min，最后用荧光显微镜观察细胞变化。2 期 王专，等：茶黄素（TF1）对人肝癌 Bel-7402 细胞的抑制作用及机制研究 289 1.2.4 细胞划痕试验 将 Bel-7402 细胞接种于 6 孔板（每孔2105个细胞）中，在 37恒温培养箱中培养24 h，用移液管尖端刮伤单层细胞，用 PBS 洗涤1 次。显微镜下拍照记录划痕宽度，加入含有不同浓度 TF1（0、50、100 molL-1和 150 molL-1）的无血清培养基，继续培养 24 h，再次显微镜下记录划痕宽度，计算每组的迁移率。迁移率的计算计算公式为：迁移率=（迁移面积/划痕面积）100%。1.2.5 Transwell 小室试验检测细胞的迁移 无血清培养基中的 Bel-7402 细胞接种到插入的过滤器中（每孔 2105个细胞）。用含血清的完全培养基作为诱导剂，用不同浓度（0、50、100 molL-1和 150 molL-1）处理Bel-7402 细胞。37 孵育 24 h 后，弃去transwell 小室中的培养液，用棉签擦去上层多余未迁移的细胞，并用 PBS 冲洗 2 次，用 4%多聚甲醛和甲醇固定，结晶紫染色，显微镜下拍照观察。1.2.6 转录组测序探索其潜在的作用机制 将 Bel-7402 细胞分成 2 组接种于 6 孔板（每孔 5105个细胞），待细胞贴壁且状态良好之后，对照组不做处理，试验组用浓度为100 molL-1的 TF1处理 24 h，弃废液，用 PBS清洗 2 次，用 TRizol 裂解细胞，提取总 RNA。Bel-7