基于图形化弹性基底的细胞牵引力测量研究_徐红梅.pdf

www.ChinaAET.com健康医疗微电子Microelectronics in Medical and Healthcare技术专栏技术专栏丨特约主编 黄成军 刘欢 朱疆基于图形化弹性基底的细胞牵引力测量研究*徐红梅1，张帆1，杜晓晗1，樊文强1，周贇2，陈修寰2，赵冠棋2，朱疆1（1.北京信息科技大学 光电测试技术及仪器教育部重点实验室，北京 100192；2.首都医科大学附属北京安贞医院，北京 100029）摘 要：细胞牵引力显微镜方法是测量细胞牵引力的主流工具之一，该方法一般使用荧光微珠作为标志点，通过测量细胞牵引力作用下荧光微珠的位移场，反演得出细胞牵引力场。由于荧光微珠在基底分布的深度不可控，但计算时候默认所有微珠分布在基底表面，一定程度上降低了细胞牵引力场的计算精度。针对荧光微珠深度不可控的问题，提出在弹性基底表面加工图形阵列作为基底变形标志点，开展细胞牵引力测量的方法。在聚二甲基硅氧烷基底表面设计直径 3 m，高度0.8 m的凸台阵列作为基底位移标志点。使用有限元仿真软件在图形化基底表面不同位置施加外力，仿真得到凸台阵列的位移场，利用牵引力反演算法计算得到力场，与仿真过程中输入的外力场相比较，结果一致。使用乳鼠心肌细胞在设计加工的图形化弹性基底上开展了牵引力测量实验，并计算得出牵引力场。仿真和实验均表明图形化弹性基底适用于细胞牵引力的测量，为心肌相关疾病病理研究提供了新的研究手段。关键词：细胞牵引力测量；图形化基底；有限元仿真；牵引力反演中图分类号：Q2-33 文献标志码：A DOI:10.16157/j.issn.0258-7998.223556中文引用格式：徐红梅，张帆，杜晓晗，等.基于图形化弹性基底的细胞牵引力测量研究J.电子技术应用，2023，49(3)：30-36.英文引用格式：Xu Hongmei，Zhang Fan，Du Xiaohan，et al.Cellular traction force measurement based on patterned elastic substrateJ.Application of Electronic Technique，2023，49(3)：30-36.Cellular traction force measurement based on patterned elastic substrateXu Hongmei1，Zhang Fan1，Du Xiaohan1，Fan Wenqiang1，Zhou Xun2，Chen Xiuhuan2，Zhao Guanqi2，Zhu Jiang1(1.Key Laboratory of the Ministry of Education for Optoelectronic Measurement Technology and Instrument，Beijing Information Science&Technology University，Beijing 100192，China；2.Beijing Anzhen Hospital，Capital Medical University，Beijing 100029，China)Abstract：Cell traction force microscopy method is one of the mainstream tools for measuring cell traction force,which uses fluorescent microbeads as markers to measure the deformation of the substrate and calculate cell traction force.However,due to the random distribution of fluorescent microbeads in the substrate,the calculation accuracy of the cell traction force field maybe affected.To address the problem of uncontrollable depth of fluorescent microbeads,a method using patterned elastic substrate was proposed to measure cell traction forces,in which the micropattern arrays fabricated on the surface of substrate was used as deformation markers.A micro-pad array with diameter of 3 m and height of 0.8 m was designed and fabricated on the polydimethylsiloxane substrate surface as the displacement markers.In the finite element simulation,external forces mimicking cell traction forces was applied at different locations on the substrate surface and the displacements field of the micro-pad array was obtained.Using the displacements field obtained by simulation,the traction force field was calculated through the traction force inversion algorithm,and the results were consistent with the input external forces in the simulation.The patterned elastic substrates were validated by mapping neonatal rat ventricular myocytes contraction forces.Both simulation and experiment demonstrate that the capacity of patterned elastic substrate for generating accurate cell contraction force maps,providing new research method for pathological study of myocardial diseases.Key words：cell traction force mapping；patterned substrates；finite element simulation；traction force inversion*基金项目：国家自然科学基金(61875237,61975019，61605011，81900454)；北京市教育委员会科技计划重点项目（KZ202011232050）30健康医疗微电子电子技术应用 2023年 第49卷 第3期Microelectronics in Medical and Healthcare技术专栏技术专栏丨特约主编 黄成军 刘欢 朱疆0 引言早期的细胞力学主要研究外力如何作用于细胞的问题。时至今日，细胞力学已从研究单个细胞力学性质发展到关注细胞与细胞、细胞与基底的相互作用。了解细胞如何产生和感知力，以及这些力如何转化为生化信号，对于解决关于正常和病理状态下细胞行为的基本问题至关重要1-2。如何精确地测量细胞对外界施加的力是生物力学研究中的关键问题3。目前，细胞牵引力测量的两大主流方法有微柱阵列法和细胞牵引力显微镜法（Cell Traction Force Microscopy，CTFM）。利用微柱阵列的方法来测量细胞牵引力，优势在于微柱的力学模型简单，算法简单。但是当微柱的间距超过悬浮细胞的尺寸时，在微柱上接种细胞时，细胞会落入微柱之间，黏附在基底上，无法进行细胞牵引力的测量。CTFM 方法的优势在于基底连续，制备方法简单，基底一般是荧光微珠和凝胶混合制备；缺点在于基底位移场和细胞牵引力场高度耦合，计算较为复杂。CTFM 方法使用的弹性基底是荧光微珠和凝胶的混合物，荧光微珠分布在凝胶的不同深度，但在解算位移场时对微珠所处的深度没有加以考虑，导致位移场计算精度受到一定影响。本文通过 Comsol 软件仿真在基底表面模拟细胞施加 150 nN 的外力，得到距离基底表面不同深度的微珠位移量，因微珠分布不均匀导致计算位移场的偏差在 0.1m 左右。所以微珠分布在基底的不同深度会影响位移场的计算精度。2016 年，Martin Bergert提出使用量子点(QDs)纳米滴印方法，在弹性基底表面形成了六边形规律排布的量子点阵列，避免了位移标志点分布随机、深度不均匀的问题。但量子点阵列制备工艺复杂，对细胞有一定毒性4。因此，针对细胞牵引力显微镜方法中荧光微珠深度不可控的问题，本文提出在弹性基底表面加工微图形阵列代替荧光微珠作为标志点的方法，开展细胞牵引力测量实验。本文首先介绍了牵引力场测量的原理；其次，对设计有微凸台阵列的弹性基底进行有限元仿真，获得弹性基底在模拟细胞力作用下产生的位移场，通过牵引力反演算法将仿真得到的位移场反演，计算得出力场，通过比较仿真过程中输入的力场与牵引力反演算法计算得出的力场是否相等，验证基底设计和算法的有效性；最后，在图形化弹性基底上接种原代乳鼠心肌细胞，并利用细胞显微成像和图像处理技术测量微凸台阵列的位移场，利用牵引力反演算法计算得到心肌细胞收缩力的大小和分布。1 测量原理CTFM 方法在细胞力学研究中发挥了重要作用，成为研究细胞黏附、迁移、细胞对外基质的力学感知等方面的重要工具5。CTFM 方法的实验部分包括弹性基底的制备、细胞培养及显微观察6。细胞牵引力的计算需要两张基底变形前后的图像7，通过显微观察获取到基底变形前后的图像后，进行实验数据处理。数据处理分为两个部分，分别是基底位移场的提取和牵引力场的反演。1.1 基底位移场的提取由于荧光微珠分布随机，常用的基底位移场的提取方法大致上可以分成两类，分别是基于模式识别技术的荧光粒子位移跟踪方法8和数字图像处理相关方法9。具体方法是利用模式识别技术对变形前后图像中的荧光微珠的位置信息进行匹配，或计算变形前后图像两个子区域的互相关系数，对两张图像中的荧光微珠进行匹配，来获得基底的位移场。对于图形化弹性基底方法而言，由于基底表面的微凸台阵列是呈周期性规律分布的，且凸台的位移小于凸台分布的空间周期，故无需复杂的图像匹配算法，只需通过图像处理计算基底受力前后两张图像中各凸台的中心坐标，将相同凸台受力前后的中心坐标做差，获得各凸台的位移矢量，即可完成基底位移场的提取。1.2 基底位移场的提取牵引力场定义为细胞施加在弹性基底表面上的应力，即单位面积的局部力。牵引力场决定了基底表面的位移场。如果弹性基底可以近似为半无限体，则可以根据表面牵引力的分布计算位移。细胞牵引力 F(r)和基底表面位移 u(r)之间满足下面的第一类 Fredholm 积分方程10：i=Gij(r-r)Fj(r)dr(1)式 中，r=(x,y)T=(x1,x2)T代 表 位 置 向 量，Gij是 基 于Boussinesq 基本解的格林函数，表达式可表示为如下形式：Gij(d)=1+Ed ij(1-)+(xi-xi)(xj-xj)d2(2)式中d=|r-r|代表相对位置向量；E 是基底的弹性模量；代 表 泊 松 比；ij是