基于多级质谱分析技术的盐酸阿霉素中特殊杂质分析_周晓迪.pdf

第 51 卷第 3 期2023 年 2 月广 州 化 工Guangzhou Chemical IndustryVol.51 No.3Mar.2023基于多级质谱分析技术的盐酸阿霉素中特殊杂质分析周晓迪,张先静,惠人杰(江南大学生命科学与健康工程学院,江苏 无锡 214122)摘 要:阿霉素是一种抗生素类药物,其抗瘤谱较广,适用于急性白血病及各种实体瘤,包括乳腺癌、卵巢癌、软组织肉瘤等,是目前临床最常使用的抗肿瘤药物之一。本文在对阿霉素进行液质联用分析时,检测到一种尚未报道的阿霉素有关物质,该物质的精确质荷比为 m/z 673.3017,经过多级质谱解析,获得其碎片信息,结合碎片信息与阿霉素的生产工艺对该有关物质的结构进行了合理推测。关键词:阿霉素;有关物质;液质联用中图分类号:R917 文献标志码:A文章编号:1001-9677(2023)03-0160-03 第一作者:周晓迪,硕士研究生,研究方向为药物分析。通讯作者:惠人杰,副教授,研究生导师,研究方向为药物分析。Analysis of Special Impurities in Adriamycin Hydrochloride Basedon Multi-stage Mass SpectrometryZHOU Xiao-di,ZHANG Xian-jing,HUI Ren-jie(School of Life Sciences and Health Engineering,Jiangnan University,Jiangsu Wuxi 214122,China)Abstract:Doxorubicin is a kind of antibiotic,which has a wide anti-tumor spectrum.It is suitable for acuteleukemia and all kinds of solid tumors including breast cancer,ovarian cancer,soft tissue sarcoma,and so on.Anunreported doxorubicin related substance,m/z 673.3017,was detected in LC-MS analysis of doxorubicin standard.Thefragment information was obtained by multi-stage mass spectrometry analysis.Its structure was reasonably speculated bythe fragment information and the production process of doxorubicin.Key words:doxorubicin;related substances;LC-MS阿霉素(Doxorubicin,DOX)是从波赛链霉菌(Streptomycespeucetius)的突变菌株中发现的一种蒽环类抗生素1,广泛应用于各种实体瘤,包括乳腺癌、骨癌、白血病等,其通过 DNA碱基之间的凹槽结合或插层与 DNA 相互作用,干扰细胞关键功能,从而导致细胞凋亡2,因此一直以来都是常用的临床抗癌药物之一。对于阿霉素如何诱导细胞死亡,已经提出了许多模型,包括抑制拓扑异构酶、DOX-DNA 复合物的形成、氧化应激和神经酰胺过度分泌,但它带来的心脏毒性一直是医药领域至今还未攻克的难题。图 1 阿霉素及有关物质的结构Fig.1 The structure of doxorubicin and its related substance第 51 卷第 3 期周晓迪,等:基于多级质谱分析技术的盐酸阿霉素中特殊杂质分析161 阿霉素的生产工艺及其纯化工艺已经相当成熟,一直以来阿霉素大多是由发酵产物柔红霉素经化学半合成而得到,也可由链霉素发酵得到阿霉素7。已报到的阿霉素杂质有四种:杂质 A、B、C、D8,具体结构见表 1;本文在阿霉素相关实验过程中新发现一种稳定出现的杂质,并对其进行多级质谱检测,结合分析结果对该物质的结构进行了合理推测。1 实 验1.1 仪器与试剂Acquity 超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱仪,Waters 公司;超纯水系统,上海乐枫生物有限公司。盐酸阿霉素,生物试剂;甲醇(色谱纯),TEDIA 公司;甲酸(质谱纯),阿拉丁生化科技股份有限公司;实验用水为超纯水。1.2 实验方法1.2.1 样品制备精密称量 1.0 mg 的盐酸阿霉素,加入甲醇稀释至 50 gmL-1,过 0.22 m 的有机膜,装入样品瓶等待 LC-MS 分析。1.2.2 液相条件色谱柱为 Waters BEH C18色谱柱(2.1 mm50 mm,1.7 m),柱温为 20;流动相为甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B),流速为 0.2 mLmin-1;紫外检测波长为 210 800 nm;进样量为3 L。色谱梯度洗脱程序为时间(min):A/B(V/V),T0:10 90,T0.1:10 90,T9:95 5,T11:95 5,T11.5:10 90,T15:10 90。1.2.3 质谱条件质谱采用电喷雾离子源(ESI),正离子 MSE模式;离子源温度为 120,脱溶剂温度为 350,锥孔电压为 40 V,低能通道碰撞能量 6 eV,高能通道碰撞能量 15 40 eV,全扫描质荷比为 50 1200 Da,扫描时间为 0.5 s。2 结果与讨论如图 2 所示,480 nm 检测波长下,阿霉素的保留时间为6.01 min,经过质谱图分析,该色谱峰中的主要成分为阿霉素,谱图中可以观察到M+H+m/z 544 及M+Na+m/z 566,同时观察到阿霉素的二聚物2M+H+m/z 1087 及2M+Na+m/z11099。图 2 阿霉素 UV 480 nm UPLC 色谱图Fig.2 UPLC at 480 nm of doxorubicin在质谱图中观察到阿霉素的碎片离子峰,根据以往的报道10,阿霉素母核的裂解途径为 544397379361321,另外阿霉素的糖苷基团也被检测到,即 m/z 130,其质谱图与裂解过程见图 3、图 4。图 3 保留时间 6.01 min 处的质谱图Fig.3 Mass spectrogram at tR=6.01 min图 4 阿霉素的裂解途径Fig.4 MS fragmentation process of doxorubicin除去以上阿霉素相关碎片离子,质谱图中另外发现了 m/z673 的未知离子峰。该离子峰与阿霉素的质荷比相差129,怀疑其为阿霉素的一种未知杂质 M。锁定 m/z 673 获得其质谱的二级图谱 MS2,锁定 m/z 570 获得其质谱的三级图谱 MS3,锁定m/z 397 获得其质谱的四级图谱 MS4见图 5。经过多级质谱分析,未知杂质 M 的质谱碎片信息包含:m/z 570、m/z552、m/z397、m/z379、m/z361、m/z321,其中碎片 m/z397、m/z379、m/z361、m/z321 与阿霉素的碎片峰一致,推断 m/z 673 与阿霉素的基本结构框架一致,均含有蒽醌的四环结构。未知杂质 M 的质谱碎片中,包含碎片峰 m/z 156,与阿霉素的氨糖碎片 m/z 130 存在 26 的质量差异,怀疑杂质结构中存在与阿霉素氨糖基团相似的结构,其修饰基团的分子质量为26。相同的质量差异同时存在于阿霉素 m/z 544 及未知杂质 M的最大质量碎片峰 m/z 570 之间。结合碎片峰 m/z570 与阿霉素多级图谱中 m/z300 400 之间的多个同碎片信息,我们有理由相信,未知杂质 M 的最大质量碎片峰 m/z570 与阿霉素结构高度相似,其主要结构差异存在于氨糖基团,且结构质量差异为26。未知杂质 M 与其最大碎片离子峰间,存在 m/z 103 的分子质量差。该分子质量差结合 m/z 26 的氨糖结构部分质量差异,即未知杂质 M 与阿霉素之间的总质量差异 m/z 129。由此可知未知杂质 M 与阿霉素之间存在两处结构差异。结合目前阿霉素的生产工艺过程,发现阿霉素主要为链霉素发酵后再加工处理,常见工艺杂质控制中反而容易忽略在生物体中广泛存在氨基酸、糖、二氧化碳等基础代谢类物质,依据所测得碎片的质量差异,以及阿霉素本身结构特性,推测在阿霉素生产过程,与 CO2以及半胱氨酸结合,最终形成未知杂质 M。162 广 州 化 工2023 年 2 月 图 5 有关物质 m/z 673 的多级质谱图Fig.5 Multi-stage mass of m/z 673阿霉素结构中,D 环侧链末端 11 号位羟基,位阻作用小,活性较高,可以与半胱氨酸中的羧基发生缩合反应,形成酯键。该酯键断裂后,可得 m/z 570 碎片离子峰。而氨糖结构中的氨基与邻位羟基活性高于半胱氨酸侧链氨基与邻位巯基,因此,更易与 CO2分子发生缩合反应,形成五元环,分子量由原先的 m/z 130 增长为 m/z 156。形成的五元结构稳定,因此在质谱裂解过程中,首先发生的是糖苷键断裂,获得 m/z 156 的碎片离子峰。而 m/z 673 的其他碎片结构推测如下:m/z 570 结构中 D 环 9 号位羟基易脱去,并形成环内双键,得碎片离子m/z 552;糖苷键断裂过程中,若羟基与杂环结构一同离去,则形成碎片 m/z174,其余诸峰 m/z397、m/z379、m/z361、m/z321 与阿霉素的碎片峰一致。具体裂解过程推导见图 6。图 6 有关物质 m/z 673 的裂解途径Fig.6 MS fragmentation process of m/z 6733 结 论本实验发现阿霉素产品中存在未知杂质 m/z 673.3017,该物质区别于欧洲药典中记载在册的几种阿霉素的有关物质。因此,对其进行多级质谱的解析,结合阿霉素的生产工艺对该杂质的结构进行推测,发现存在两处结构修饰,分别为阿霉素中活性基团与半胱氨酸及 CO2反应所得。参考文献1 Lown J W.Discovery and development of anthracycline antitumourantibioticsJ.Chemical Society Reviews,1993,22(3):165-176.2 Jawad B,Poudel L,Podgornik R,et al.Molecular mechanism andbinding free energy of doxorubicin intercalation in DNAJ.PhysicalChemistry Chemical Physics,2019,21(7):3877-3893.3 Gewirtz D.A critical evaluation of the mechanisms of action proposed forthe antitumor effects of the anthracycline antibiotics adriamycin anddaunorubicinJ.Biochemical Pharmacology,1999,57(7):727-741.4 Minotti G,Menna P,Salvatorelli E,et al.Anthracyclines:Molecularadvances and pharmacologic developments in antitumor activity andcardiotoxicityJ.Pharmacological Reviews,2005,56(2):185-229.5 SenchenkovA,LitvakDA,CabotMC.TargetingCeramideMetabolisma Strategy for Overcoming Drug Resistance