基于化学模式识别分析的五神汤指纹图谱研究_王冉.pdf

第 51 卷第 3 期2023 年 2 月广 州 化 工Guangzhou Chemical IndustryVol.51 No.3Mar.2023基于化学模式识别分析的五神汤指纹图谱研究王 冉1,闫占宽2,吴文静1,高 珣1,秦昆明1(1 江苏海洋大学药学院,江苏 连云港 222000;2 江苏原创药物研发有限公司,江苏 连云港 222000)摘 要:采用色谱柱Aglient Eclipse XDB-C18(4.6 mm150 mm,5 m),流动相为乙腈-0.1%磷酸水,梯度洗脱,流速1.0 mL/min,检测波长254 nm,柱温30,进样量10 L。建立五神汤 HPLC 指纹图谱(相似度0.960)。结合化学模式识别法对结果进行分析。以绿原酸为参照峰,共标定了19 个共有峰,并指认出其中8 个色谱峰。聚类分析将结果聚为4 类,主成分分析和偏最小二乘判别分析坏筛选出了9 个引起批次间差异的成分。本文所建立的五神汤指纹图谱方法简单、灵敏,可用于五神汤的质量控制及评价。关键词:五神汤;指纹图谱;化学计量学分析;质量控制中图分类号:R917 文献标志码:A文章编号:1001-9677(2023)03-0155-05 第一作者:王冉(1997-),女,硕士研究生,主要研究方向为中药分析。通讯作者:高珣,博士,讲师,主要从事中药药效物质基础、代谢组学及质量控制的研究工作。Study on Fingerprint of Wushen Decoction Based on ChemicalPattern Recognition MethodWANG Ran1,YAN Zhan-kuan2,WU Wen-jing1,GAO Xun1,QIN Kun-ming1(1 School of Pharmacy,Jiangsu Ocean University,Jiangsu Lianyungang 222000;2 Jiangsu Origin Drug Research Co.,Ltd.,Jiangsu Lianyungang 222000,China)Abstract:Aglient Eclipse XDB-C18(4.6 mm150 mm,5 m)was used for gradients elution with acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution as mobile phase.Working conditions were as follows:the column temperature was 30,the flow rate was 1.0 mL/min,the detection wavelength was 254 nm and the injection volume was 10 L.The quality ofWushen Decoction was carried out by the similarity evaluation system(similarity degrees 0.90).The results wereanalyzed by chemical pattern recognition.Based on chlorogenic acid,a total of 19 common peaks were demarcated,and 8chromatographic peaks were identified.The results were grouped into 4 groups by HCA.PCA and PLS-DA failed toscreen out 9 components that caused the difference between batches.The method of Wushen Decoction HPLC fingerprintwas sensitivity and specificity,which can be used for the quality control of Wushen Decoction.Key words:Wushen Decoction;fingerprint;chemometrics analysis;quality control五神汤(Wushen Decoction,WSD)最早出自清陈士铎的洞天奥旨卷七骨痈(公元 1694 年),处方由金银花、紫花地丁、牛膝、茯苓和车前子 5 味药材组成1。原方用于治疗骨痈,其中金银花做君药,辅以紫花地丁,茯苓、车前子为佐使、牛膝为使药。五神汤利湿解毒,方中金银花2、紫花地丁3清热解毒、凉血消肿;茯苓4、车前子5利尿通淋、渗湿止渴;牛膝6活血散瘀、引血下行。五药合用,既解毒,又利湿。目前在临床上五神汤主要用于慢性骨髓炎的治疗7。目前,对于五神汤的研究较少且多停留在临床应用方面,未见有学者进行质量控制方面的研究。由于中药成分复杂,产地与批次均会影响药材的质量8,故而导致复方质量的不稳定性而影响临床治疗效果。指纹图谱技术可以对中药的化学信息进行综合整合,从而全面反应中药的成分信息,借助化学计量学分析,可以更加直观的表现出药材复杂成分之间的关联9-11,为中药复方的研究与开发奠定良好基础12-13。本研究拟采用 HPLC 法建立五神汤的指纹图谱,并对结果进行相似度评价及化学模式识别分析,以期为五神汤的质量控制提供依据。1 仪器与材料岛津 LC-20AD 型 高 效 液 相 色 谱 仪,日 本 岛 津 公 司;XS205DU 型十万分之一电子分析天平,瑞士梅特勒-托利多公司;KQ2200DE 型数控超声波清洗器,昆山市超声仪器有限责任公司;DFY-200A 型高速万能粉碎机,上海比郎仪器有限公司;Avanti J-26SXP 型高速冷冻离心机,美国贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司。五神汤中的各味药材购买江苏、河南、河北、江西、四川、山东等地,置于干燥阴凉处备用。全部药材经过中国医科大学药学院靳鑫老师的鉴定,各饮片均符合 中国药典 2020年版 一 部 的 相 关 性 状 规 定。对 照 品-蜕 皮 甾 酮(批 号:FY00B5006,纯度:98%);京尼平苷酸(批号:FY161B7628,纯度:98%);秦皮甲素(批号:FY00B4067,纯度:98%);毛蕊花 糖 苷(FY1624B0602,纯 度:98%);秦 皮 乙 素(批 号:FY00B5112,纯度:98%);咖啡酸(批号:FY132B5723,纯156 广 州 化 工2023 年 2 月度:99%);木犀草苷(批号:FY1466B7017,纯度:98%);绿原酸(批号:FY1435B516,纯度:98%)均购于南通飞宇生物科技有限公司。色谱级甲醇、乙腈西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;磷酸(质量分数为85%),国药集团化学试剂有限公司;本实验所用的其余试剂均为分析纯。2 方法与结果2.1 对照品溶液的制备分别取秦皮甲素、秦皮乙素、木犀草苷、-蜕皮甾酮、京尼平苷酸、咖啡酸、绿原酸、毛蕊花糖苷适量,精密称定,用50%甲 醇 溶 解 并 定 容 成 终 浓 度 分 别 为 415.60、422.40、371.20、579.20、356.00、453.60、425.20、381.60 g/mL 的混合对照品溶液,置于 4 下备用。2.2 供试品溶液制备精密称量 1 g 五神汤药材粉末,加入 10 mL 50%甲醇溶液,并称定质重,超声处理40 min 后放冷至室温再次称重,用50%的甲醇溶液补足超声提取中缺失的重量。离心(5000 r/min,10 min)取上清液过 0.22 m 滤膜,取续滤液,即得。2.3 色谱条件色谱柱:Aglient Eclipse XDB-C18(4.6 150 mm,5 m);以 0.1%磷酸溶液(A)和乙腈(B)作为流动相进行梯度洗脱,检测波长:254 nm;体积流速:1.0 mL/min;柱温:30;进样量:10 L。梯度洗脱程序见表 1。表 1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program of HPLC methodt/minA/%B/%0955890101588122582184575255565356559565.01595759552.4 指纹图谱方法学验证2.4.1 精密度试验取已过筛的五神汤样品粉末(S1),按“2.2”项下的方法制备五神汤供试品溶液,并在“2.3”项下的色谱条件下连续进样6 次,以绿原酸峰作为参比,19 个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的 RSD 均2.98%,表明该色谱仪器的精密度良好。2.4.2 重复性试验称取过筛的 S1 批次五神汤样品粉末,运用“2.2”项下的方法平行制备供试品溶液 6 份,并在“2.3”项下的色谱条件下分别进样检测,以绿原酸峰作为参照峰,计算 19 个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的 RSD 值结果均3.00%,证明建立的本方法重复性良好。2.4.3 稳定性试验称取过筛的 S1 批次的五神汤样品粉末,以“2.2”项下的方法制备供试品溶液,在室温下放置后的 0、2、4、8、12 和24 h 分别注入色谱仪器分析,以绿原酸峰作为参比峰,计算出19 个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的 RSD 值均 1 作为标准进行五神汤中的主成分分析,模型自动提取出来 5 个主成分,主成分分析的结果见表 4。数据结果表明,峰 1、4(京尼平苷酸)、6(秦皮甲素)、9(咖啡158 广 州 化 工2023 年 2 月酸)、11、14(木犀草苷)、19 在主成分 1 上有较高载荷,峰 5、8(秦皮乙素)、13 在主成分 2 上的载荷较高,峰 2、10、12 在主成分 3 上有较高载荷,峰 10 在主成分 4 上有较高载荷,峰 3在主成分 5 上有较高载荷。表 4 WSD 主成分因子载荷矩阵Table 4 Factor load matrix of WSDPeak numberPC1PC2PC3PC4PC510.9420.000-0.122-0.1220.22020.254-0.4530.535-0.435-0.0943-0.7300.270-0.0120.4200.40240.8510.039-0.4230.0260.2265-0.2130.696-0.1700.3870.04160.8470.079-0.1770.105-0.34070.544-0.5370.4710.3500.10380.265-0.737-0.5090.2400.11990.8700.0330.061-0.029-0.43110-0.289-0.1980.5900.618-0.311110.847-0.223-0.2320.118-0.312120.6940.3490.5480.2050.12713-0.0050.8260.276-0.233-0.317140.8840.145-0.4040.006-0.025150.661-0.5060.2730.2230.140160.6400.486-0.2570.460-0.071170.6780.2750.410-0.2910.377180.7980.3090.4190.1630.173190.9250.188-0.015-0.1840.1812.6.3 偏最小二乘判别分析(PLS-DA)图 4 10 批样品 PLS-DA 得分图Fig.4 PLS-DA score chart of 10 batches of WSD图 5 10 批样品偏最小二乘判别分析 VIP 值Fig.5 VIP plot of 10 batches of WSD将10 批五神汤的19 个共有峰的峰面积作为 Y 变量,以 S1 S10 作为 X 变量,导入到 SIMCA-P 13.0 软件进行 PLS-DA 建模分析,得分图见图4。在95%的置信区间内样品被聚为4 类,进一步验证了聚