基于过程优化探索蛋白印迹技术的实验教学设计_葛家祥.pdf

ISSN 1006 7167CN 31 1707/TESEACH AND EXPLOATION IN LABOATOY第 42 卷 第 1 期Vol 42 No12023 年 1 月Jan 2023DOI:10 19927/j cnki syyt 2023 01 044基于过程优化探索蛋白印迹技术的实验教学设计葛家祥a，尚佳琪a，刘江a，邓仕婧a，林牒a，杨琳b(天津中医药大学 a 中西医结合学院;b 医学技术学院，天津 301617)摘要:为了提高蛋白印迹实验的成功率及缩短蛋白印迹实验的周期，探索符合实验教学的过程方案，以蛋白印迹法实验操作为模板，以-actin(48 kDa)为目的蛋白，以 GAPDH(36 kDa)为标准蛋白，通过改变实验条件，计算-actin 与 GAPDH 显影后灰度值的比值，进行实验过程的优化。并对优化前后实验过程中在制胶、加样、电泳、转膜、封闭以及孵育等环节的成功率、离散度、所用时间等方面进行比较。结果表明，优化后的免疫印迹法能有效地提高成功率、降低离散度、缩短实验时间，-actin 与 GAPDH 显影后灰度值比值更接近 1，达到实验教学的要求。关键词:蛋白印迹;过程优化;方法改进;实验教学中图分类号:G 642;N 33;N 45文献标志码:A文章编号:1006 7167(2023)01 0223 06Experimental Teaching Design of Western BlottingBased on Process OptimizationGE Jiaxianga，SHANG Jiaqia，LIU Jianga，DENG Shijinga，LIN Diea，YANG Linb(a College of Integrated Chinese and Western Medicine;b College of Medical Technology，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 301617，China)Abstract:In order to improve the success rate of Western blot experiment and shorten the cycle of Western blotexperiment，this paper explores the process scheme in line with experimental teaching The Western blot is used as thetemplate，-actin(48 kDa)as the target protein and GAPDH(36 kDa)as the standard protein The ratio of-actin toGAPDH is used to optimize the experimental process Comparing before and after the optimization of the experimentalprocess，we can see that the success rate is high，the dispersion is low and the time is shortened after the optimization inthe links of glue preparation，sample addition，electrophoresis，membrane transfer，sealing and incubationWeconclude that the improved immunoblotting method can effectively improve the success rate，shorten the experimentaltime and shorten the experimental time The ratio of-actin to GAPDH is closer to 1，which meets the requirements ofexperimental teachingKey words:western blot;process optimization;method improvement;experimental teaching收稿日期:2022-02-26基金项目:国家自然科学基金青年项目(81704004);国家自然科学基金面上项目(82174470);全国中医药高等教育“十四五”规划 2021 年度教育科研课题(YB-20-17);天津市普通高等学校本科教学质量与教学改革研究计划项目(B201006301)作者简介:葛家祥(2000 )，男，河北衡水人，本科生，医学专业。Tel:17320286071;E-mail:992325836 qq com通信作者:杨琳(1978 )，女，天津人，博士，高级实验师，主要研究方向为中医药防治心脑血管疾病。Tel:13116043798;E-mail:158005329 qq com0引言蛋白印迹(免疫印迹)技术(Western Blot，WB)是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法1-4。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。依据该技术原理形成将电第 42 卷泳分离后的细胞或组织总蛋白从凝胶转到 PVDF 膜上2，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白检测技术。现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面5-6。查阅实验类文献、相关实验技术论坛以及对该实验方法的实操，发现蛋白印迹技术的实验方法具有操作周期长，实验操作复杂，实验过程中所需试剂、用品繁琐，实验条件(如温度，转膜液的浓度，电泳时间等)要求高的特点，而且实验结果经常会出现显影时背影深，杂带明显，转膜失败等问题5。基于以上若干问题，本文在实验过程中针对繁琐的实验环节进行优化，制定出规范标准的 WB 实验操作方案，在保证实验质量的基础上节省时间，同时为实验教学提供一点实验思路5。1实验材料1.1实验仪器电泳仪(24DN 1903-20，北京市六一仪器厂)、电转仪(090913AM，美国伯乐)、微量移液器(各种量程，中国大龙)、离心机(D1008，美国基因)、摇床(HNY-901H，中国欧诺)、凝胶成像系统(美国伯乐)、电子分析天平(TD20002C，天津天马衡基)、半干转仪器(221B 58321，690B020874，美国伯乐)。1.2实验试剂10%十二烷基硫酸钠(SDS，Solarbio)、四甲基乙二胺(TEMED，Solarbio)、1.5 mol Tris-HCL(pH8.8)(T1010，Solarbio)、30%丙烯酰胺(A1010，Solarbio)、牛血清白蛋白(BSA，A8020，Solarbio)、1.0 mol Tris-HCL(pH6.8)(T1020，Solarbio)、10%过硫酸铵(Solarbio)、Markerd 蛋 白(#26616，Thermo Fisher)、10 TBST(T1081，Solarbio)、脱脂牛奶(D8340，Solarbio)、辣根过氧化酶标记(羊抗兔 IgG)(ZB-2301，中杉金桥)、10 转膜液(T1021，Solarbio)、5 电泳缓冲液(T1022，Solarbio)、显影剂(ZD310-1，ZOMANBIO)、-actin 单克隆抗体(bs-0061，中国博士德)、GAPDH 单克隆抗体(中国博士德)。1.3实验耗材滤纸(1703965，美国伯乐)、PVDF 膜(IPVH00010，美国 Millipore)。2源于实验教学的蛋白印迹实验方法 7-82.1制胶方法2 1 1分离胶和浓缩胶的比例选择根据所分离的 40 50 kDa 蛋白分子量的目的蛋白，选择 12%分离胶以及 5%浓缩胶的相关试剂进行制备(见表 1)。表 1分离胶、浓缩胶的试剂成分组成试剂10 mL12%分离胶/mL 4 mL5%浓缩胶/mL双蒸水332230%丙烯酰胺4006715 mol Tris-HCL(pH8.8)2510 mol Tris-HCL(pH6.8)1010%SDS0100410%过硫酸铵01004TEMED00010 0042 1 2灌胶方法(1)清洗玻璃板，晾干后备用。(2)将晾干后的玻璃板对齐垂直放入配角架中卡紧制胶。(3)将配置好的分离胶用移液器吸取适量的体积沿玻璃板内侧缓缓加入，防止出现气泡，然后吸入双蒸水封闭。等到看见双蒸水和分离胶之间出现了一条分界线时倒出双蒸水，用吸水纸吸干水分。(4)分离胶凝后将剩下的空间加满浓缩胶，然后选择合适孔径的齿梳垂直插入玻璃板内，避免出现气泡，等待浓缩胶凝固行上样操作。2.2上样操作10(1)将经过100 加热过的蛋白质样品冷却至室温，离心、混匀，待上样。(2)往电泳槽里加电泳液(电泳液要没过内侧短玻璃板)。(3)将齿梳拔出，用移液器选择合适的量加入孔径中，双侧加入等体积的 Marker 蛋白，样品逐一进行加入。2.3电泳操作11 在进行电泳时，电压首先设置 80 V 电泳0 5 h，等到浓缩胶电泳完毕后，电压设置为 100 V 行分离胶电泳 1 h(若分离胶的量太少则需要延长电泳时间)，电泳时将电泳仪放在冰上，防止蛋白扩散。2.4转膜方法11-13(1)在托盘中加入 1 的含甲醇的转膜液，将转膜用的海绵两块、夹子、玻璃棒、PVDF 膜、滤纸等浸入转膜液中。每块海绵上放置 3 层滤纸压实，一块放在黑色模具，一块放在白色模具上，注意不要出现气泡(如图 1 所示，放置顺序自下而上(自负极至正极)依次为白色筛孔板，海绵垫，滤纸，凝胶，PVDF 膜，滤纸，海绵垫，黑色筛孔板)。(2)根据目的条带的大小，依据 Marker 指示位置切胶，将切好的胶放在黑色模具的海绵上，注意不要让胶干燥。(3)将 PVDF 膜压在胶上，注意不要有气泡，铺好后将白色模具上的海绵和滤纸压在膜上，注意避免发422第 1 期葛家祥，等:基于过程优化探索蛋白印迹技术的实验教学设计生滑动，将夹子夹紧。(4)将模具放置在转膜槽中，黑色模具面对应黑色面。在转膜槽中加入转膜液，使其没过条带的位置，将转膜槽放置在冰盒中。转膜时为恒流电流，电流为200 mA，转膜时间为 2 h。图 1转膜夹心放置顺序2.5封闭操作14 转膜完成后，将膜转到封闭容器中，加入 5%(含TBST)BSA，封闭 1 h。2.6一抗孵育15 将 PVDF 膜放在含有一抗稀释液的容器中(-actin 兔多克隆抗体以 1 5 000 比例稀释在 5%BSA中)，放置在摇床上，4 过夜，取出后1 TBST 洗涤每次 5 min，共计 3 次。2.7二抗孵育15 将 PVDF 膜放在含有二抗稀释液的容器中(辣根过氧化酶标记的羊抗兔 IgG 抗体以 1 5 000 比例稀释在 5%BSA 中)，放置在摇床上，室温孵育 2 h。取出后1 TBST 洗涤 3 次，每次 5 min。2.8显影条带上加上显影剂显影。综上所述，目前教学实验中常规蛋白印迹的基本操作流程由制胶、上样、电泳、转膜、孵育、封闭、显影环节组成，其中以电泳后的步骤更为零乱琐碎，操作起来易出错，为更好方便记忆特以流程图形式进行展示(见图 2)。图 2蛋白印迹法基本操作过程3蛋白印迹实验方法优化鉴于目前实验教学中，常规蛋白印迹的操作环节众多，影响因素众多，因而经过多次实验探索，在制胶、上样、电泳、转膜、封闭、孵育环节进行优化，分别在用量、时间、仪器的选择以及试剂的更换和使用次数等方面进行优化并进行对比(见表 2)。表 2蛋白印迹优化前后实验环节的对比实验环节优化前优化后制胶制分离胶(10 mL 12