基于代谢组学对延安五倍子蜂蜜特征物筛选的研究_张冯斌.pdf

6 0APICULTURE OF CHINA基于代谢组学对延安五倍子蜂蜜特征物筛选的研究张冯斌1 方冲伟1 李斌1 马玉莲1 康科1 王鑫1 吴黎明2（1 黄龙县养蜂试验站；2 中国农业科学院蜜蜂研究所）摘 要：陕西延安地区盛产高质量五倍子蜂蜜，然而常有低价多花蜜冒充五倍子蜂蜜的现象发生，严重损害蜂农和消费者的利益。本研究以延安地区五倍子蜂蜜和多花蜜为主要研究对象，系统分析了两类蜂蜜中的酚类化合物，并结合多元统计分析，筛选出次黄岑素可作为这两类蜂蜜的差异化合物。进一步通过建立UHPLC-MS/MS 方法对蜂蜜中的次黄岑素进行准确定量，其在五倍子蜂蜜中的含量为 30100 g/kg，而在百花蜜中的含量低于 5 g/kg。本研究为延安地区五倍子蜂蜜的质量控制提供了一定的参考依据。关键词：五倍子蜂蜜；代谢组学；特征化合物；次黄岑素 Research on screening characteristic compounds of gallnut honey from Yanan of China based on metabonomicsZhang Fengbin1,Fang Chongwei1,Li Bin1,Ma Yulian1,Kangke1,Wang Xin1,Wu Liming2(1 Huanglong Beekeeping Experimental Station;2 Institute of Apicultural Research,Chinese Academy of Agricultural Sciences)Abstract:High quality gallnut honey is abundant in Yanan,Shaanxi province.However,low-price multi-flower honey is often simulated as gallnut honey,which seriously infl uence the interests of bee farmers and consumers.In this study,the phenolic compounds in the two kinds of honey were systematically analyzed.Combined with multivariate statistical analysis,wogonin was selected as the diff erential compounds between the two kinds of honey.Furthermore,UHPLC-MS/MS method was established to accurately quantify the content of wogonin in honey.The content of wogonin in gallnut honey was 30100 g/kg,but less than 5 g/kg in multi-fl ower honey.This study provides some reference for the quality control of gallnut honey in Yanan area.Key words:gallnut honey;metabonomics;characteristic compounds;wogonin蜂蜜冒充高价的五倍子蜂蜜进行销售，这种“以次充好”的造假方式不仅从外观上很难区分，非五倍子蜂蜜冒充五倍子蜂蜜的现象对延安地区五倍子蜂蜜声誉构成了威胁，并且极大损害了消费者利益。蜂蜜中酚类化合物总量约有 56500 mg/kg，蜂蜜中这些植物的次级代谢产物不仅赋予其多种活性功能2，如抗氧化、抗炎和抗菌等，除此以外，蜂蜜中的酚类化合物也是重要的植物源和地理源标志物。1991 年，Ferreres 等 9 位学者证明3，可以通过鉴定蜂蜜酚酸和黄酮的成分和含量来确定蜂蜜的花源和地理起源。荆条蜜中主要是皂草黄素，槲皮素是向日葵花蜜的特征性成分，没食子酸是石楠花蜜的特征性成分，橙皮素是柑桔蜜中五倍子蜂蜜属于中药蜜的一种，采自漆树科落叶小乔木的五倍子花蜜，未结晶时呈质地浓稠、光泽的琥珀色或深琥珀色，具有五倍子花特有的自然香味，味道有一丝丝苦味和中药材味，作为中药蜜种，五倍子蜂蜜具有调理肠胃、解毒、杀菌和清热去火等作用，备受市场认可，其市场需求量逐年增加。五倍子蜜属于稀有蜜种，产量不及油菜蜜、洋槐蜜和荆条蜜等国内主要蜜种，售价高于普通蜂蜜1。陕西延安地区以独特的地理资源优势，生长有多种蜜源植物，其中就有丰富的五倍子。延安地区的五倍子蜂蜜品质优良，深受消费者青睐。然而，近来一些不良商家受到利益驱使，将与五倍子蜂蜜色泽相近的低价通讯作者：吴黎明，E-mail:研究论文2023 年 1 月 蜂业研究中国蜂业6 1的特征性成分4。本研究主要以延安地区的五倍子蜂蜜为研究对象，通过与多花蜂蜜比较分析其中的酚类化合物，结合多元统计分析筛选出延安地区五倍子蜂蜜的特征化合物，进一步建立特征化合物的准确定量方法，为该地区五倍子蜂蜜的质量控制提供一定的理论参考依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂试验用五倍子蜂蜜、百花蜜，于 2021 年收集于延安当地蜂场，实验用水为纯净水杭州娃哈哈集团有限公司、甲醇（LC-MS级，美国Merk公司）、乙腈（LC-MS级，美国 Merk 公司），水为超纯水（Milli-Q SP Regent Water system，美国）碘（分析纯）：天津永晟精细化工有限公司；碘化钾（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；乙酸钠、可溶性淀粉（分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司；冰乙酸（色谱纯）：美国TEDIA公司；氯化钠（分析纯）、乙腈（色谱纯）：北京Dikma公司；羟甲基糠醛（分析纯）：日本 Sigma 公司；果糖、葡萄糖、麦芽糖（分析纯）：Aladdin公司；蔗糖（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。1.2 仪器与设备美国安捷伦公司 6560 系列；超声波清洗机：AS3120A 型，深圳市洁盟清洗设备有限公司；电子天平：FA22048 型，上海精科天美科学仪器有限公司；超纯水系统（Milli-Q Gradient）：美国 MILLIPORE 公司；WSTERS2690 超高压液相色谱仪：沃特世公司；紫外可见分光光度计（UV-2600）：苏州岛津仪器有限公司；阿贝折光仪（ARIAS500）：美国 REICHERT 公司。1.3 试验方法1.3.1 五倍子蜂蜜理化指标的检测蜂蜜中果糖、葡萄糖和蔗糖的含量根据国标 GB 5009.8-2016 方法测定5：称取混匀后的试样 1 g2 g（精确到 0.001 g）于 50 mL 容量瓶，加水定容至 50 mL，充分摇匀，用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，后续滤液用0.45 m 微孔滤膜过滤或离心获取。上清液过 0.45 m 微孔滤膜至样品瓶，供液相色谱分析6。蜂蜜中的水分根据商检行业推荐性标准 SN/T 0852-2012 测定7：在测定前先将棱镜擦洗干净，以免留有其他物质影响测定精度。用玻璃棒蘸取混匀的试样12滴，滴于下面的棱镜上，迅速闭合棱镜，静置数秒钟，以待样品达到40对准光源，由目镜观察，转动补偿器螺旋，使明暗分界线清晰；转动标尺指针螺旋，使其明暗分界线恰好通过接物镜上十字线的交点。读取标尺上的折光指数，同时核对温度，恰为 408。蜂蜜中淀粉酶活性根据国标 GB/T 18932.16-2003 测定9：淀粉酶活性检测采用 GB/T 18932.162003蜂蜜中淀粉酶值的测定方法分光光度法规定的方法检测。将配制好的淀粉溶液与处理过的样品溶液充分混匀，在40水浴条件下，部分淀粉被蜂蜜溶液中的淀粉酶水解后，剩余淀粉与碘反应产生蓝紫色，随着淀粉酶水解作用，蓝紫色反应逐渐消失，用分光光度计于 660 nm 波长处测定吸光度达到 0.235 时所需时间，换算出样品中淀粉酶值10。蜂蜜中羟甲基糠醛含量根据国标 GB/T 18932.18-2003 测定11：称取 10 g 试样，精确至 0.01 g，置于 100 mL烧杯中，加入10 mL甲醇，用玻璃棒轻轻搅拌均匀，使试样完全溶解。转移至 100 mL 容量瓶中，用水释稀至刻度，充分混匀。用 0.45 m 的滤膜过滤，滤液用于液相色谱仪紫外检测器测定12。1.3.2 蜂蜜酚类化合物分析方法蜂蜜样品前处理方法：称取 5 g 蜂蜜，加 5 ml 水，涡旋 2 min；加入 10 ml 乙腈，涡旋 2 min，视情况超声或增加涡旋时间促进结晶蜂蜜的溶解；加入 QuEChERs Extract pouch，EN Method 5982-0650（安捷伦内部小包装货号），涡旋 2 min；4，8000 rpm，离心 10 min，取全部上清（8 ml 左右，取一致）；真空旋转蒸发仪3540，2500rpm，旋转蒸发至微干；复溶：用 1 mL甲醇复溶，上机13。酚类化合物仪器分析方法：采用安捷伦超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱(UPLC-QqQ-MS/MS)对鉴定的标记物进行定量分析14。色谱条件：采用双溶剂体系，流动相 A 为超纯水，0.1%(v/v)甲酸，流动相 B 为乙腈。流速 0.3 mL/min，进样量 2 L。梯度洗脱程序每次运行开始在 5%B 和 B 1 分钟保持在 5%，那么 B 在2 分钟增加到 35%，35%到 50%的 B 从 2 到 3 分钟，50%到 75%的 B 3 到 5 分钟，75%到 100%的 B 从 5 到5.1 分钟，并保持在 100%B 从 5.1 到 7 分钟，然后 B 7.1分钟下降到 5%，保持在 5%B 从 7.1 到 10.0 分钟，发布时间是 3 分钟。洗脱液从 0 到 0.5 分钟转向。柱恒温器保持在 40。质谱条件：对于质谱分析，质谱数据采集采用多反应监测(MRM)模式，在正电离模式下采集。电喷雾电离(ESI)设置如下：干气温度，200；干气流量，15 L/min；喷雾器压力，45 psi；护套气温 330；鞘气流量，12 L/min；喷嘴电压 1.5 kV；毛细管电压，3.5 研究论文2023 年 1 月 蜂业研究6 2APICULTURE OF CHINA降维原理简化数据后对数据进行可视化处理，可用于不同品种、不同加工方式等的化学识别及归类。由 PCA散点图可知（图 1-A），基于酚类化合物的分布可将五倍子蜂蜜样品与百花蜜样品显著区分。进一步，通过OPLS-DA 散点图（图 1-B）也清楚显示五倍子蜂蜜及百花蜜样品分别分布于两个不同区域，说明这两类蜂蜜样品酚类化合物组成存在较大差异。聚类分析也将两类蜂蜜有效区分，如图 1-C 所示。进一步，通过 OPLS-DA映射图（图 1-D），可以筛选出区分两类蜂蜜样品的重要酚类化合物，图 1-C 的峰值和图 1-D 的分布看出两样品中特征物的差异，这些主要的差异化合物列在表 2中，主要包括 16 种化合物。VIP 值越大，表明对五倍子蜂蜜和多花蜂蜜的区分贡献越大。其中筛选出次黄岑素并通过在实际样品中进一步验证，确定在五倍子蜂蜜中其含量远高于多花蜜中的含量，可作为潜在的延安地区五倍子蜂蜜的特征酚类化合物。kV15。1.3.3 数据处理多元统计分析是用 SIMCA 软件实施的。主成分分析（PCA）、聚类分析和正交偏最小二乘判别分析法（OPLS-DA）是被用来区分五倍子蜂蜜和多花蜂蜜样品。VIP 值 1（p0.05）的因子是通过 OPLS 模型提取出的能显著区分不同蜂蜜样品的因素。2 结果与分析2.1 五倍子蜂蜜理化指标分析结果延安五倍子蜂蜜相关常规理化指标如表 1 所示，果糖和葡萄糖含量、淀粉酶活性显著优于标准规定指标（P0.05），水分远低于相关标准，蔗糖未检出，延安五倍子蜂蜜相关理化指标符合蜂蜜行业标准GH/T18796-2012的一级品指标16。试验所测蜂