基于分子信标策略的CRIS...于循环肿瘤DNA的放大检测_张函笑.pdf

第 51 卷分析化学（FENXI HUAXUE）研究报告第 2 期2023 年 2 月Chinese Journal of Analytical Chemistry184193DOI:10.19756/j.issn.0253-3820.221203基于分子信标策略的CRISPR/Cas12a荧光传感器用于循环肿瘤DNA的放大检测张函笑代晓春周亚楠吕旭珍弓韬赵旭华*于保锋*（山西医科大学基础医学院，生物化学与分子生物学教研室，太原 030001）摘要构建了一种以分子信标（Molecular beacon，MB）为信号探针的 CRISPR/Cas12a 生物传感器，用于循环肿瘤 DNA（Circular tumor DNA，ctDNA）的快速放大检测。MB 具有良好的稳定性，其颈部末端分别标记有荧光素（FAM）和四甲基罗丹明（TAMRA）两种荧光基团。ctDNA 不存在时，CRISPR/Cas12a 体系无活性，无法切割 MB，因此 MB 两端的荧光基团由于形成发夹结构的颈部相互靠近而发生荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET），显示出 TAMRA 的荧光。当 ctDNA 存在时，ctDNA 特异性识别 Cas12a/crRNA 二元复合物并激活 Cas12a 的反式切割活性。由于单链 DNA 是 Cas12a 最敏感的底物，因此MB 的环部单链首先被切割，继而引起颈部双链的解离而导致两种荧光团彼此远离，无法发生 FRET，最终显示出 FAM 的荧光信号。对 MB 环部的碱基数目、MB 浓度以及 crRNA 与 Cas12a 的浓度比例等实验条件进行了优化。在最优条件下，1.7500 pmol/L 范围内，ctDNA 浓度与传感器在 518 nm 处的荧光强度呈线性关系，检出限为 0.6 pmol/L（3）。将此传感器用于血清样品中 ctDNA 的检测，回收率在 93%110%之间。关键词 CRISPR；生物传感器；荧光共振能量转移；循环肿瘤DNA目前，癌症已经成为威胁人类健康并导致死亡的重大疾病之一1，这主要源于肿瘤的发病机制复杂、诊断不及时和进展速度快等因素2。因此，早期的精准诊断与及时治疗对于降低癌症患者的发病率和死亡率至关重要3。组织活检是癌症诊断最常用的技术4，然而其具有创伤性、耗时长、成本高且易感染等不足5。液体活检是一种无创、低成本且可以克服异质性的诊断方法，为实时评估肿瘤的变化带来了极大的便利6。循环肿瘤 DNA（Circular tumor DNA，ctDNA）是由肿瘤细胞释放到外周血中的DNA 小片段（常为单链或双链 DNA），是液体活检中最重要的生物标志物之一7。ctDNA 在血液中含量低，并且半衰期较短（16150 min），因此对 ctDNA 的准确检测具有挑战性8。目前，常用的 ctDNA 检测方法包括聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）9、基因测序10、电化学分析法11和比色法12等。但这些方法具有很多不足，例如，PCR 方法的步骤复杂，容易受到生物样本的干扰13；DNA 测序需要昂贵的设备和较长的分析时间（23 周），无法足临床快速检测的需求。因此，开发灵敏度高、操作简单、快速且低成本的 ctDNA 检测方法非常必要。成簇的有规律间隔的短回文重复（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及相关蛋白（CRISPR associated protein，Cas）组成的CRISPR/Cas 系统是广泛存在于细菌中的一种获得性免疫机制14-16。作为 2V 类的 CRISPR 系统，CRISPR/Cas12a 体系由特异性识别核酸序列的引导 RNA（crRNA）和 Cas12a 蛋白组成17。研究发现，在 crRNA 的引导下，Cas12a 蛋白不仅具有特异性识别靶标序列并且切割靶标序列的顺式切割活性18，还具有无选择性地切割周围 DNA 序列的反式切割活性19。研究者基于 CRISPR/Cas12a 体系的反式切割特性构建了多种生物传感平台。Ren 研究组20将滚环扩增技术和 Cas12a 体系结合，构建了一种双放大体系用于 miRNA 的超灵敏检测；Lu 研究组21将功能研 究 报 告2022-04-26 收稿;2022-12-01 接受山西省自然科学基金项目(Nos.202103021224240，201901D211317，201901D111190)、山西医科大学细胞生理学教育部重点实验室开放基金项目(No.KLMEC/SXMU-202011)和山西省“1331工程”重点学科建设计划项目(No.1331KSC)资助。*E-mail:;核酸的特异性识别能力和 Cas12a 体系的信号放大技术相结合，开发了一种可以检测非核酸类目标物的荧光生物传感系统。这些传感器都以两端分别标记有荧光基团（FAM）和淬灭基团（BHQ）的单链 DNA（Single-stranded DNA，ssDNA）作为信号探针，具有灵敏度高和切割速度快等优势，但 ssDNA 信号探针的序列长度受限（通常为 5 个碱基），并且在复杂的生物样本中稳定性较差，限制了其应用范围22-23。除ssDNA 信号探针外，双链 DNA（Double-stranded DNA，dsDNA）也可作为 CRISPR/Cas12a 体系的信号探针19，24。研究结果表明，相比于 ssDNA 信号探针，dsDNA 信号探针的稳定性高、通用性好（探针序列的长度不受限制），但是相对而言，Cas12a 蛋白酶对 dsDNA 的酶切速度明显下降（长达数小时以上），并且切割速度受金属离子浓度影响较大25，进而影响其检测速度。为了构建同时具备 ssDNA 和 dsDNA优势的信号探针，研究者将注意力转移到分子信标探针（Molecular beacon，MB）上。MB 是一段具有茎-环结构的 DNA 序列，5和 3末端可分别标记荧光基团和猝灭基团。自由状态下，MB 呈发夹结构，荧光团和淬灭团彼此靠近发生能量共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET），荧光被猝灭；目标物存在时，与 MB 分子结合，使 MB 的空间构象发生变化，发夹结构打开，淬灭基团远离荧光基团，荧光得以恢复。本研究采用具有颈环结构的 MB 作为信号探针，构建了一种 CRISPR/Cas12a 生物传感器用于 ctDNA的放大检测。标记于 MB 颈部末端的荧光素（FAM）和四甲基罗丹明（TAMRA）荧光基团是一对常见的FRET 转移对，其颈部碱基的杂交使供体 FAM 与受体 TAMRA 之间发生 FRET 效应。当存在靶标序列ctDNA 时，被激活的 Cas12a 切割 MB 并引起颈部双链的解离，导致两种荧光团彼此远离，FRET 现象减弱，从而实现 ctDNA 的放大检测。MB 信号探针的设计具有诸多优势：首先，由于 CRISPR/Cas12a 体系对 ssDNA 底物最敏感，所以 MB 探针环部的 ssDNA 可被 CRISPR/Cas12a 体系快速识别并切割，从而提高了目标物的检测速度；其次，MB 颈部的 dsDNA 设计既降低了荧光探针的背景信号，又增加了探针在复杂样品中的稳定性。将本传感器用于血清样本中 ctDNA 的测定，结果令人满意。1实验部分1.1仪器与试剂RF-6000 荧光分光光度计（日本岛津公司）；FE-28 pH 计（美国 Mettler-Toledo 公司）；Bio-rad 荧光凝胶成像仪（美国 Bio-rad 公司）。NaCl、MgCl2、乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA2H2O）、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，C8H18N2O4S）、6DNA 上样缓冲液、30%聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）胶液、过硫酸铵（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）、胶红染料（GelRed）和SYBR Green 核酸染料均购于北京索莱宝科技有限公司；EnGenLbaCas12a 及10NE缓冲液（50 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L MgCl2，100 g/mL BSA，pH 7.9）购自美国New England Biolabs公司。以上试剂均为分析纯，直接使用；实验用水为Millipore纯水系统（美国Millipore公司）制备的超纯水（18.2 Mcm）。DEPC 水及本实验所用的所有的DNA序列、DNA marker购于生工生物工程（上海）股份有限公司，crRNA序列购买于上海吉玛制药有限公司，DNA 和 RNA序列见表1。1.2实验方法1.2.1Cas12a/crRNA二元复合物的制备移取 0.6 L Cas12a（1 mol/L）和 0.6 L crRNA（1 mol/L）至 EP 管中，补加 1NEB 缓冲液至体积为6 L，混匀，37 水浴反应 30 min，形成 100 nmol/L 的 Cas12a/crRNA 二元复合物。1.2.2ctDNA检测方法移取 10 L Cas12a/crRNA 二元复合物（10 nmol/L）至 PCR 管中，加入 10 L 不同浓度的 ctDNA，再加入 4 L MB（2 mol/L），最后补加 DEPC 水至 30 L，混匀，37 水浴反应 40 min，再于 65 反应 15 min使酶失活。反应结束后，补加缓冲液（20 mmol/L HEPES，10 mmol/L Mg（NO3）2，100 mmol/L NaNO3）至总体积为 100 L，测定体系的荧光强度。激发波长为 490 nm，激发和发射狭缝宽度均为 5 nm，发射波长范围为 510650 nm。第 2 期张函笑等：基于分子信标策略的CRISPR/Cas12a荧光传感器用于循环肿瘤DNA的放大检测1851.2.3非变性PAGE实验将 10 L Cas12a/crRNA 二元复合物（20 nmol/L）和 5 L ctDNA（2 mol/L）加入 EP 管中，再分别加入5 L 等浓度（2 mol/L）的 ssDNA、MB 和 dsDNA，补加 DEPC 水至 30 L，混匀，37 水浴反应不同时间（10 和 20 min），再于 65 孵育 15 min，使酶失活。将 10 L 样品和 2 L 6上样缓冲液混合，进行 PAGE（12%），室温下在 1TAE 缓冲液（40 mmol/LTris-HCl，2 mmol/L EDTA，pH 8.5）中电泳 40 min，电压为 120 V。电泳结束后，用 GelRed（110000）染色30 min；最后，通过 Bio-rad 荧光凝胶成像系统采集图像。1.2.4血液样品分析血液样本由山西省太原市中医院提供，相关研究已获得了相关机构审查委员会的批准，参与者知情同意。血液样本首先在 4 以 10000 r/min 离心 10 min，上层血清在 65 水浴加热 15 min，灭活脱氧核糖核酸酶，然后用超纯水稀释 10 倍。最后，将不同浓度的 ctDNA 添加至血清样品中，按照 1.2.2 节的方法进行测定，计算回收率。2结果与讨论2.1实验原理基于 MB 探针的 CRISPR/Cas12a 荧光传感器的设计原理如图 1 所示。MB 探针的颈部末端分别标记有 FAM（供体）和 TAMRA（受体）两种荧光基团。当不存在目标物 ctDNA 时，CRISPR/Cas12a 体系无切割活性，MB 两端的荧光基团通过颈部杂交靠近而发生 FRET 过程，在 494 nm 激发光下显示 TAMRA 的荧光。当加入目标物 ctDNA 后，ctDNA 特异性识别 Cas12a/crRNA 二元复合物并激活了 Cas12a 的反式切割活性。MB 的环部 ssDNA 首先被裂解，并引起颈部 dsDNA 的解离。此时，两种荧光基团彼此远离导致FRE