第51卷分析化学（FENXIHUAXUE）研究报告第2期2023年2月ChineseJournalofAnalyticalChemistry184~193DOI:10.19756/j.issn.0253-3820.221203基于分子信标策略的CRISPR/Cas12a荧光传感器用于循环肿瘤DNA的放大检测张函笑代晓春周亚楠吕旭珍弓韬赵旭华*于保锋*（山西医科大学基础医学院，生物化学与分子生物学教研室，太原030001）摘要构建了一种以分子信标（Molecularbeacon，MB）为信号探针的CRISPR/Cas12a生物传感器，用于循环肿瘤DNA（CirculartumorDNA，ctDNA）的快速放大检测。MB具有良好的稳定性，其颈部末端分别标记有荧光素（FAM）和四甲基罗丹明（TAMRA）两种荧光基团。ctDNA不存在时，CRISPR/Cas12a体系无活性，无法切割MB，因此MB两端的荧光基团由于形成发夹结构的颈部相互靠近而发生荧光共振能量转移（Fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET），显示出TAMRA的荧光。当ctDNA存在时，ctDNA特异性识别Cas12a/crRNA二元复合物并激活Cas12a的反式切割活性。由于单链DNA是Cas12a最敏感的底物，因此MB的环部单链首先被切割，继而引起颈部双链的解离而导致两种荧光团彼此远离，无法发生FRET，最终显示出FAM的荧光信号。对MB环部的碱基数目、MB浓度以及crRNA与Cas12a的浓度比例等实验条件进行了优化。在最优条件下，1.7~500pmol/L范围内，ctDNA浓度与传感器在518nm处的荧光强度呈线性关系，检出限为0.6pmol/L（3σ）。将此传感器用于血清样品中ctDNA的检测，回收率在93%~110%之间。关键词CRISPR；生物传感器；荧光共振能量转移；循环肿瘤DNA目前，癌症已经成为威胁人类健康并导致死亡的重大疾病之一[1]，这主要源于肿瘤的发病机制复杂、诊断不及时和进展速度快等因素[2]。因此，早期的精准诊断与及时治疗对于降低癌症患者的发病率和死亡率至关重要[3]。组织活检是癌症诊断最常用的技术[4]，然而其具有创伤性、耗时长、成本高且易感染等不足[5]。液体活检是一种无创、低成本且可以克服异质性的诊断方法，为实时评估肿瘤的变化带来了极大的便利[6]。循环肿瘤DNA（CirculartumorDNA，ctDNA）是由肿瘤细胞释放到外周血中的DNA小片段（常为单链或双链DNA），是液体活检中最重要的生物标志物之一[7]。ctDNA在血液中含量低，并且半衰期较短（16~150min），因此对ctDNA的准确检测具有挑战性[8]。目前，常用的ctDNA检测方法包括聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction，PCR）[9]、基因测序[10]、电化学分析法[11]和比色法[12]等。但这些方法具有很多...
