基于光谱法研究汞荧光分子探针与人血清白蛋白的相互作用_陈昕.pdf

第 52 卷 第 3 期2023 年 3 月Vol.52 No.3Mar.2023化工技术与开发Technology&Development of Chemical Industry基于光谱法研究汞荧光分子探针与人血清白蛋白的相互作用陈昕1，刘元艳2，马明硕3，陈杰3，刘治刚3，曾晓丹3（1.吉林化工学院研究生学院，吉林 吉林 132022；2.吉林石化公司质量检验中心，吉林 吉林 132022；3.吉林化工学院分析测试中心，吉林 吉林 132022）摘要：采用荧光光谱技术，研究了不同温度下用于识别汞的荧光分子探针（WL-6）与生物大分子人血清白蛋白（HSA）的结合机理。结果表明，HSA在结合位点的荧光强度，随着WL-6的浓度增加而显著降低。根据荧光数据，得到了WL-6与HSA作用的结合常数、主要作用力及猝灭常数。从紫外吸收光谱、荧光光谱、同步荧光、三维荧光光谱和圆二色谱的结果可以看出，WL-6的结合改变了HSA的构象。关键词：荧光探针；人血清白蛋白；结合常数中图分类号：TQ 422+.4 文献标识码：A 文章编号：1671-9905(2023)03-0001-06基金项目：吉林省科技厅项目(20220203020SF)；国家自然科学基金项目（51902125）通信联系人：曾晓丹，女，副教授，研究方向：荧光分子探针的设计合成与应用研究。E-mail:收稿日期：2022-09-26研究与开发血清白蛋白是生物体血浆中含量最多的蛋白质，在生物体中的作用，是与进入生物体的小分子物质结合，并将小分子物质运输到体内的相应位置，从而发挥小分子物质的作用，因此经常被用作小分子物质的靶标物质1。萘酰亚胺类化合物具有优异的光化学稳定性和热稳定性，常作为荧光材料，广泛应用于医药2、太阳能电池3、荧光探针4-6等领域。本文设计并合成了一种基于萘酰亚胺的荧光探针（图 1），用于测定 Hg2+7。通过体外模拟生理条件，利用荧光光谱，研究了探针 WL-6 与 HSA 的相互作用，探讨了探针与HSA 相互作用的荧光猝灭机理，得到了探针与 HSA的结合位点、结合常数和热力学参数，并依据紫外吸收光谱、荧光光谱、同步荧光光谱、三维荧光光谱和圆二色谱的数据，研究了探针的结合对 HSA 结构的影响，得到此类探针与蛋白质分子的作用规律的数据，从而对此类探针的设计以及作用机理提供科学依据。同时，可以依据小探针分子和蛋白质的结合类型、结合强度和生理效应等，设计出具有高灵敏度、高选择性的探针。OONOOS图 1探针 WL-6 的化学结构式1实验部分1.1材料99%HSA：浓度 10-5 molL-1，加入蒸馏水配制而成。探针 WL-6 母液：浓度 10-3molL-1，用三氯甲烷配制。Tris 缓冲溶液：pH=7.4，浓度 10-2molL-1。1.2仪器UV-2550 紫外分光光度计，荧光分光光度计，Jasco-810 圆二色谱，PHSJ-4A pH 计。1.3实验方法移取 HSA、适量的探针 WL-6 母液和乙醇溶液，用 Tris-HCl 缓 冲 溶 液 定 容 至 5mL（HSA：2 moLL-1，WL-6：010moLL-1，乙 醇 水=19，v/v）。将溶液摇匀分装后，置于恒温水浴（298K、303K、308K）中 30min，进行测试。2化工技术与开发 第 52 卷 在 290450 nm 扫描范围内，记录 298 K、303 K与 308 K 下，探针与 HSA 相互作用的荧光光谱，激发波长为 280nm，激发和发射狭缝均为 5.0nm。分别设置为 15nm 与 60nm，记录探针与HSA 作用前后，在 200350 nm 范围内的谱图。在 激 发 波 长 为 200280nm、发 射 波 长 为350450nm、步长为 10nm 的条件下，记录探针与HSA 作用前后的三维荧光光谱。记录 200600 nm 范围内的 UV-Vis 吸收光谱谱图。使用 0.1cm 的比色皿，在 200350 nm 范围内，记录探针 WL-6(8moLL-1)与 HSA(2moLL-1)作用前后的 CD 光谱，以 Tris 缓冲溶液作为参比。2结果与讨论2.1WL-6 与 HSA 相互作用的 UV-Vis 吸收光谱紫外-可见吸收光谱是在检测结构变化和复合物的形成过程时常用的一种简单便捷的方法。280nm的吸收峰，可以显示出血清白蛋白中的色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等这类芳香族氨基酸的变化8。图 2是不同浓度的 WL-6 对 HSA 的紫外吸收光谱的影响。由图 2 可知，HSA 在 280nm 处具有很强的紫外吸收峰，且吸收光谱的峰值随着 WL-6 浓度的增加而增加，同时伴随着最大吸收峰从 278nm 蓝移到 275 nm。由此可以看出，WL-6 的加入使得 HSA的肽链伸展，暴露了人血清白蛋白中的酪氨酸残基和色氨酸残基上的芳香杂环疏水基团，从而影响了 HSA 的结构。这种构象变化有利于芳香杂环的-*跃迁，因此吸光度增强了9。10MAbsorbance0M200Wavelength/nm3004005006001.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10.0图 2探针 WL-6 对 HSA 的紫外-可见吸收光谱的影响2.2WL-6 与 HSA 相互作用的荧光光谱血清白蛋白分子有内源荧光，主要是由于色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸中含有共轭双键和苯环结构，它们对微环境的变化，可通过荧光强度表现出来，但它们的激发波长为 280nm，最大发射波长为 335nm，而 WL-6 的最大发射波长在 550nm 左右，因此本研究可以忽略“内滤光效应”的干扰问题。图 3 是不同浓度的 WL-6 与 HSA 相互作用的荧光光谱。可以看出，WL-6 的加入使得 HSA 的荧光强度出现明显下降。随着 WL-6 的浓度增加，HSA 的荧光强度呈线性下降，说明 WL-6 可以与 HSA 相互作用，从而降低 HSA 的荧光10。5004003002001000Fluorsecence intensity/a.u.280300340400440320380360420460wavelength/nm0M10M图 3不同浓度的 WL-6 对 HSA 的荧光光谱根据猝灭常数随温度的变化关系，荧光猝灭可分为静态猝灭和动态猝灭两类，它们的猝灭常数随着温度的变化，呈现不同的变化趋势。随温度升高，猝灭常数增加，则属于动态猝灭，是由扩散引起的；而由基态复合物引起的静态猝灭，猝灭常数会减小。静态猝灭常数可由 Stern-Volmer 方程获得：F0/F=1+KSVQ=1+Kqt0Q (1)式中，KSV为淬灭常数；F0为无淬灭剂时血清白蛋白的荧光强度；F 为淬灭剂浓度为 Q 时血清白蛋白的荧光强度；0为无猝灭剂时一般荧光分子的平均寿命，10-8s；Kq为荧光猝灭常数；Q 为淬灭剂浓度。为了进一步研究 WL-6 与 HSA 的相互作用，我们记录了 WL-6 与 HSA 在 3 个不同温度下相互作用的荧光数据，绘制了相应的 Stern-Volmer 曲线（图4）。由图 4 可见，F0/F 与 Q 的线性关系良好，并且随着温度的升高，斜率减小。由式（1）得到的 3 种不同温3第 3 期 陈昕等：基于光谱法研究汞荧光分子探针与人血清白蛋白的相互作用度下的 Ksv和 Kq值列于表 1。由于 Kq的值远大于最大扩散碰撞淬灭常数 2.01010 Lmol-1s-1，因此荧光淬灭可能主要由静态淬灭主导。1.41.21.00.80.60.40.20.0 F0/F0426Q/molL-18298K303K308K10图 4不同温度下探针 WL-6 猝灭 HSA 荧光的 Stern-Volmer 图表 1探针 WL-6 与 HSA 在不同温度下的 Ksv和 Kq值pH温度/K KSV/Lmol-1Kq/Lmol-1s-1R7.4752983033131.141050.881050.811051.1410130.8810130.8110130.97170.98210.98242.3探针 WL-6 与 HSA 相互作用的结合位点数及结合常数依据静态猝灭理论，生物大分子中含有相似且独立的结合位点。如果是静态猝灭，则可以通过式（2），获得探针与 HSA 相互作用的结合位点数及结合常数：logF0-FF=logK+nlogQ(2)探针与 HSA 相互作用的结合常数 K 和结合位点数 n，可以分别由式(2)中的 log(F0F)/F 对logQ 的二次回归曲线（图 5）中的截距和斜率获得。K 和 n 的计算值列于表 2。探针 WL-6 与 HSA 的结合位点数 n 约为 1，表明 HSA 分子可以结合 1 个WL-6 探针分子。由表 2 的数据可以看出，随着温度升高，K 和 n 的值都在减小。前文提到，温度会影响 Ksv和 Kq的值，这表明在结合过程中形成了不稳定的配合物，一些配合物会随着温度的升高而发生分解，也进一步验证了猝灭机理为静态猝灭。2.4探针 WL-6 与 HSA 相互作用的热力学分析和作用力类型化合物小分子与生物体内的生物大分子之间的常见结合力，可通过结合反应的热力学参数 H、S来确定，主要包括疏水作用力、氢键、范德华力、静电引力等相互作用力类型11。当 H 0、S 0 时，代表疏水力主导结合过程；H 0、S 0 时，代表静电作用主导结合过程；当 H 0、S 0 时，表明氢键和范德华力主导结合过程。因此，通过相关热力学参数的计算，可以得到 WL-6和 HSA 之间的相互作用力。假设焓变(H)在一定温度范围内的变化很小，可当作一个常数处理，那么 S和 H可以通过 van Hoff 方程 式(3)计算得到：G=H-TS（3）式中，K为温度T下的结合常数；R为气体常数。可通过式(4)计算结合反应的自由能变化，得到的数据列于表 3。从表 3 可见，H 0，S 0，表明静电作用主导结合过程；同时 G 0，因此结合反应是自发进行的。lnK=-HRT+SR（4）表 3不同温度下 WL-6 与 HSA 作用的热力学参数pH温度/KG/Jmol-1H/Jmol-1S/Jmol-1K-17.475298303313-28848.73-28683.52-28935.36-38695.1933.0433.0431.690.20.0-0.2-0.4-0.6-0.8-1.0-1.2-1.4-1.6-1.8log(F0-F)/F-0.6-5.6logQ-5.2-5.8-5.4-5.0298K303K308K图 5不同温度下探针 WL-6 猝灭 HSA 的 log(F0-F)/F 对 logQ 的曲线图表 2探针与 HSA 相互作用的结合位点数 n 和结合常数 KpH温度/K结合常数 K/Lmol-1nR7.4752983033083.181052.871051.781051.511.081.080.98860.98910.98394化工技术与开发 第 52 卷 2.5探针 WL-6 与 HSA 之间的结合距离探针 WL-6 与 HSA 的结合距离，可根据 Frster的非放射共振能量转移理论计算得到，同时还可以得到能量转移效率 E 和能量转移临界距离 R0。根据 Frster 理论，能量转移效率 E 由式（5）计算得到：E=1-FF0=R06R06+r6（5）式中，R06为转移效率为 50%时的临界距离；r为受体和供体之间的距离。R06可由式(6)计算得到：R06=8.810-25K2n-4FDJ（6）式中，n 为介质的折射指数；K2为偶极子的空间定位因子；J 为血清白蛋白的发射光谱和探针WL-6 吸收光谱之间的光谱重叠系数；FD为供体的荧光量子产量。图 6 是探针 WL-6 的吸收光谱和 HSA 的荧光发射光谱，可以通过式(7)计算得到 J：=004)()()(dFdFJ（7）式中，F()为供体分子在波长 处的荧光强度值；()为受体分子在波长 处的摩尔吸收系数。40030020010000.100.080.060.040.020.00Absorbance