基于镜检和高通量测序技术的铜锈环棱螺胃含物分析_张灿灿.pdf

淡水渔业，2023，53(2):84 93Freshwater Fisheries2023 年 3 月Mar.2023收稿日期:2022-03-12;修订日期:2022-11-02资助项目:广西柳州市财政资金资助项目(LZT18-201)第一作者简介:张灿灿(2000)，女，学士本科生，专业方向为水产养殖。E-mail:1346221401 qq com通讯作者:李艳和。E-mail:liyanhe mail hzau edu cn基于镜检和高通量测序技术的铜锈环棱螺胃含物分析张灿灿1，张丹丹1，王志强2，罗福广2，文衍红2，蒋明3，李艳和1(1 华中农业大学水产学院/水产养殖国家级实验教学示范中心，武汉 430070;2 广西柳州市渔业技术推广站，广西柳州 545006;3 中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉 430223)摘要:以养殖的铜锈环棱螺(Bellamya aeruginosa)为研究对象，采用镜检和高通量测序技术分析其胃含物情况。结果显示:铜锈环棱螺的摄食率为 86 87%，其胃含物以浮游植物和碎屑为主，其中胃内主要的食物成分是小球藻(Chlorella)和裸藻(Euglena)，后肠中则以隐藻和颤藻为主;铜锈环棱螺胃内微生物菌群主要由变形菌门、放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门等 23 门和盐单胞菌属(Halomonas)、乳球菌属(Lactococcus)、肉杆菌属(Carnobacterium)等88 属组成，其中真菌类群主要由子囊菌门、担子菌门等 5 门和马拉色氏霉菌属(Malassezia)、曲霉菌属(Aspergil-lus)、被孢霉属(Mortierella)等50 属组成。研究结果可为铜锈环棱螺饵料生物学和生态食物网研究提供基础资料，为开展其人工养殖提供基础生物学基础。关键词:铜锈环棱螺(Bellamya aeruginosa);胃含物;高通量测序;显微镜镜检中图分类号:S966 2文献标识码:A文章编号:1000-6907-(2023)02-0084-10铜锈环棱螺(Bellamya aeruginosa)是我国主要的土著淡水螺类群体之一，属于软体动物门腹足纲前鳃亚纲中腹足目田螺科环棱螺属1。据研究，新鲜螺肉营养价值高，含有人体所必需的 7 种氨基酸、多种矿物元素及维生素等2，具有天然保健功能，使其在多种行业及水生态保护修复中都具有重要作用与突出价值1。铜锈环棱螺的市场需求量逐年增大，但其人工养殖技术的发展却较为滞后，目前主要依靠人工捕捞，供应量远小于其市场需求量。因此，深入开展铜锈环棱螺的人工养殖、营养需求、饵料投喂和繁育特性等研究显得尤为重要。而动物的食性研究是营养生态位研究的重要组成部分3，可以为动物的食物选择性、物质代谢、繁育特性以及人工养殖等研究提供有价值的参考资料和基础数据4。高通量测序具有较高灵敏性和准确性，能检出降解和频次较低的 DNA 序列，通过比对捕获的DNA，可将物种精确分类到种级别分类单元，基于DNA 序列数，还可判断动物对食物取食的相对量和偏好5。显微镜镜检分析一直是动物食性研究中的传统方法6，7，是一种检验动物短期内摄食的直接手段，该方法使用显微镜观察并分析肠胃内含物中未被消化的食物种类和数量，可以反映动物在近期内的摄食情况。然而，大量的研究表明每一种食性研究方法在实际应用中均存在局限性。将镜检分析这种传统的食性研究方法与高通量测序这种新兴方法相结合，可以突破单种方法的局限性，提高对生物食性研究的可靠性8。目前有关螺类的食性已有较多研究，屈铭志等9 通过模拟水库现场，直接观察铜锈环棱螺的摄食行为。段晓姣10、刘学勤11 基于镜检分析法，分别对梨形环棱螺(Bellamya purificata)、长角涵螺(Alocinma longicornis)、大沼螺(Parafossaruluseximius)和纹沼螺(Parafossarulus striatulus)的肠道内含物进行鉴定，分析了其食性。而将高通量测序技术和镜检鉴定结合起来，分析铜锈环棱螺胃和后肠内容物组成的研究较少。本研究选取真核生物18S 可变区 V4 区、细菌 16S V3V4(a)和真菌 ITS1(a)作为标记基因，结合高通量测序技术和镜检鉴别结果，对铜锈环棱螺的食性进行研究，以期为开展环棱螺人工养殖、营养需求、饵料投喂和繁育特性研究提供重要的基础数据和资料。1材料与方法DOI:10.13721/ki.dsyy.2023.02.006第 2 期张灿灿等:基于镜检和高通量测序技术的铜锈环棱螺胃含物分析11样品采集2021 年 4 月 2 日，在广西柳州里高镇螺蛳养殖基地某铜锈环棱螺高产水田随机采集铜锈环棱螺样本若干(60 个以上)。采样后将螺样放入清水中进行冲洗，去除表面的底泥，用吸水纸吸干表面水分，测量其体高、体重及壳宽。12显微镜镜检将每个螺的胃和后肠移入盛有 10 20 L 生理盐水的培养皿中充分洗涤后制成镜检样品。利用显微镜镜检法鉴别全部镜检样品。藻类及浮游动物参照文献 12 15 鉴定到属。13高通量测序随机选取 30 个铜锈环棱螺用无菌镊子将胃分离，每 10 个一组，参照文献 16 中的 SDS 法对环棱螺胃含物的基因组 DNA 进行提取。采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计法检测 DNA 质量与浓度。DNA 检测合格后，分别选用针对真核生物 18S 可变区 V4 区、细菌 16S V3V4(a)和真菌 ITS1(a)区设计的三对特异性引物(表1)对其进行 PC 扩增。PC 产物经纯化、浓度检测合格后，使用 Illumina公司的 TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 进行文库构建，构建好的文库经过定量和检测，利用 No-vaSeq 6000 SP eagent Kit(500 cycles)进行2 250bp 的双端测序。测序工作在上海派森诺生物科技股份有限公司完成。表 1PC 引物信息Tab 1 Information of the PC primers区域长度/bp引物名称引物序列(5-3)16S rDNA V3-V4468338Fbarcode+ACTCCTACGGGAGGCAGCA806GGACTACHVGGGTWTCTAAT18S V4420547FCCAGCASCYGCGGTAATTCCV4ACTTTCGTTCTTGATYAITS V1250 500ITS5GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGITS2GCTGCGTTCTTCATCGATGC注:barcode 为一个 7 个碱基的寡核苷酸序列，用来区分同一文库中的不同样品。14数据处理与分析1 4 1摄食强度分析参照文献 17 的判断方法，对铜锈环棱螺肠道充塞度进行分级(0 5 级)。1 4 2食物组成分析分别计算铜锈环棱螺的摄食率(F)、食物出现率(F)、数量百分比(N)、重量百分比(W)和相对重要性指数百分比(II)，评估铜锈环棱螺胃和后肠的食物组成情况，计算方法如下:F=(含有食物的肠道数量 解剖的总肠道数量)100%F=(包含某食物的肠道数量 解剖的总肠道数量)100%N=(某食物成分的数量 全部食物的数量)100%W=(某食物成分的重量 全部食物的重量)100%相对重要性指数=F (个数百分比 N%+重量百分比 W%)II=(相对重要性指数 相对重要性指数总和)100%1 4 3测序数据分析首先对测序原始数据进行质控、去噪、拼接、去嵌合体。对每个 OTU 的代表序列，在 QIIME2 软件中使用默认参数，使用 Naive Bayes 分类器进行物种分类注释。比对 Greengenes 数据库18，统计每个样本的胃含物在界、门、纲、目、科、属、种分类水平的组成。2结果21铜锈环棱螺的摄食强度共分析 30 只铜锈环棱螺，体高分布范围为13 48 22 41 mm，体质量分布范围为 0 44 2 27g，结果表明取样随机，大小均有，可以反映养殖阶段铜锈环棱螺胃含物组成的共性。其中，26 个肠道含食物，4 个肠道完全无食物，摄食率为58淡水渔业2023 年86 87%。由图 1 可看出，铜锈环棱螺的充塞度主要集中在 1 级，即食物占肠管的 1/4，其次主要是 2级，食物占肠管的 1/2，而充塞度为 5 级的最少为 0。图 1铜锈环棱螺肠道充塞度情况Fig 1The intestinal fullness of B aeruginosa22镜检分析铜锈环棱螺胃和后肠中食物组成情况总共有 30 个样本用于食物组成分析，壳宽在8 89 15 09 mm 之间。由表 2 可以看出，从铜锈环棱螺胃中检出藻类 8 门 33 属，解剖发现铜锈环棱螺的胃肠道里主要食物是浮游植物，如裸藻、颤藻、扁裸藻、黄丝藻等(图2)，还有较多的泥沙和有机碎屑，以及少量的水生植物碎屑。从出现率来看，胃中小球藻最高为 63 33%，其次黄丝藻为 46 67%;后肠隐藻最高为 43 33%，其次小球藻和黄丝藻均为 33 33%，颤藻为 30%，席藻、栅藻、双菱藻、羽纹藻、实球藻、卵囊藻、小环藻、黄管藻和三毛金藻最低为 3 33%。从数量百分比来看，胃中小球藻最高为34 42%，席藻、图 2显微镜视野下的铜锈环棱螺胃内部分食物种类Fig 2Some stomach contents in B aeruginosa under microscope蹄形藻最低为0 05%;后肠颤藻最高为21 85%，席藻、栅藻、双菱藻和羽纹藻最低为0 18%。除去泥沙，从重量百分比来看，胃中裸藻门为 46 16%，绿藻门为 35 70%，蓝藻门为6 68%，硅藻门为6 19%，隐 藻 门 为 5 27%，其 中 裸 藻 最 高 为46 16%，其次为衣藻 22 74%;后肠 蓝 藻 门 为39 96%，隐藻门为 18 19%，绿藻门为 16 76%，裸藻门为 15 59%，硅藻门为 9 49%，其中颤藻最高为 39 96%，其次隐藻为 18 19%。从相对重要指数百分比来看，胃中小球藻最高为 37 66%，其次衣藻为 23 09%;后肠中颤藻最高为 35 74%，其次隐藻为 25 58%(表2)。表 2铜锈环棱螺的食物组成Tab 2Diet compositions of B aeruginosa部位食物种类F/%N/%W/%II/%胃蓝藻门颤藻(Oscillatoriales)404 026 677 39微囊藻(Microcystis)13 330 460 010 11螺旋藻(Spirulina)3 330 5700 03平裂藻(Merismopedia)3 330 210 010 01色球藻(Chroococcus)13 330 6700 15席藻(Phormidium)3 330 0500硅藻门小环藻(Cyclotella)16 676 084 032 91舟形藻(Navicula)301 441 911 74布纹藻(Gyrosigma)100 31针杆藻(Syneclra)3 330 410 140 03双菱藻(Surirella)100 72直链藻(Aulacoseira)3 330 10 10 0168第 2 期张灿灿等:基于镜检和高通量测序技术的铜锈环棱螺胃含物分析续表 2部位食物种类F/%N/%W/%II/%羽纹藻(Pinnularia)6 670 1卵形藻(Cocconeis)100 31绿藻门衣藻(Clamydomonas)36 6713 722 7423 09小球藻(Chlorella)63 3334 42037 66鼓藻(Cosmarium)23 331 7500 71团藻(Volvox)13 330 2100 05实球藻(Pandorina)13 3312 9812 935 97转板藻(Mougeotia)6 670 100 01鞘藻(Oedogonium)301 1800 61韦氏藻(Westella)3 330 21蹄形藻(Kirchneriella)3 330 0500卵囊藻(Oocystis)6 6