基于核基因和微卫星的叶城沙蜥遗传多样性分析_谢慧.pdf

基于核基因和微卫星的叶城沙蜥遗传多样性分析谢 慧，蒋罗雪，赵 伟，祁 玥，段嘉宝，李孟纯，刘筱烨，李 铀，（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州；兰州大学生命科学学院甘肃省环境生物监测与修复重点实验室，甘肃兰州；西北民族大学生物医学研究中心 甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃兰州）摘要 为了研究我国特有物种叶城沙蜥（）的遗传多样性，采用微卫星和核基因分子标记方法，对新疆 个地区所采集的 只叶城沙蜥进行了遗传多样性分析。基于对 个微卫星位点和核基因 的 扩增及琼脂糖凝胶电泳检测，利用软件进行分析，结果表明群体单倍型多样性为 和平均核酸多样性为 ，观察到的杂合度平均值和预期杂合度平均值分别为 和，总 值为，发现试验研究所采集的叶城沙蜥群体存在明显的遗传差异及种群间存在较大的遗传分化。综合分析说明采集的叶城沙蜥群群体间遗传交流水平低，存在较高程度的遗传分化，但由于样本较少仍需对叶城沙蜥种群遗传特征进一步研究。补充和丰富了新疆部分地区叶城沙蜥的基础遗传数据，为后续合理利用及保护该地区内其他物种的种质资源奠定了基础。关键词 叶城沙蜥；微卫星；脑源性神经营养因子（）；遗传；种群中图分类号 文献标识码 文章编号（）：开放科学（资源服务）标识码（）：，（，；，），；基金项目 国家自然科学基金地区科学基金项目（）；甘肃省自然科学基金项目（）；西北民族大学中央高校 基 本 科 研 业 务 费 项 目（，）；西 北 民 族 大 学 研 究 生 科 研 创 新 项 目（）。作者简介 谢慧（），女，河南商丘人，硕士研究生，研究方向：动物遗传育种与繁殖。通信作者，副教授，博士，硕士生导师，从事分子生态与进化生物学研究。收稿日期 叶城沙蜥（）是鬣蜥科（）沙蜥属（）的爬行动物，属于我国特有的一种小型爬行动物，已被列入世界自然保护联盟（）年濒危物种红色名录。广泛分布于我国甘肃、西藏、新疆天山山脉南部地区，包括塔里木盆地及周边的吐鲁番哈密盆地和敦煌盆地。栖息在戈壁荒漠或沙漠边缘地带以及固定沙丘的丘间平地，有少数植被覆盖，垂直分布的海拔高度为 ，在阿尔金山南麓甚至可达 左右。利用线粒体基因对于叶城沙蜥种群遗传结构的研究未得到很好的解析，有可能与其分化时间太短或不完全谱系分选有关。而基于微卫星位点变异速率快、多态性高等特点，有望更全面地解析叶城沙蜥的种群遗传结构。微卫星标记，又称简短串联重复（，）或简单序列重复（，），是一种基于 长度多态性的分子标记技术。微卫星 由于具有特异性的 扩增、多态信息容量（）高、引物通用性好、突变率高、共显性、符合孟德尔遗传、易于检测等优势，已被广泛应用于种群遗传、谱系地理和亲子鉴定等领域。微卫星标记较线粒体基因更具丰富的多态性，也是野生动物遗传学分析常用的分子标记之一，研究者可以利用分子标记研究种群的扩散模式，从而更有效地保护和管理野生动物。仲光启等筛选了在黑鹳上可扩增的 个微卫星位点并进行了遗传特点分析，王萌等探讨了微卫星标记方法在大型猫科动物保护群遗传学研究中的应用与挑战，刘旭等概述了微卫星技术在珍稀濒危野生动物中的相关应用以及分子生物学手段在珍稀濒危野生动物扩散生态学的研究情况。对于沙蜥属的研究主要与环境气候变化有关，有红尾沙蜥超氧化物歧化酶适应高原的分子机制、青海沙蜥遗传和表型分化的环境相关性、增温对青海沙蜥繁殖生活史及后代适合度的影响等。目前关于叶城沙蜥中的研究相对较少，主要在两性异形和形态特征差异、线粒体和基于高通量测序微卫星特征分析，而关于微卫星分析研究较少。该研究利用高质量的 标记评估 只叶城沙蜥的遗传多样性，解析不同群体遗传结构，为叶城沙蜥及新疆地区的物种保护提供理论依据。该研究利用 个微卫星安徽农业科学，（）：位点和 对核基因引物，分析了 个地理种群 个样本的遗传多样性、遗传分化和系统地理结构，对叶城沙蜥进行系统发育分析，补充和丰富新疆地区叶城沙蜥的基础遗传数据，为保护该地区内其他物种提供参考。材料与方法 试验材料 试验研究对象为新疆 个地区（且末、民丰、策勒、和田、皮山、叶城、喀什）采集的 只叶城沙蜥，将组织样本均置于无水乙醇与生理盐水（配比）组织保存液中，保存备用（表）。表 叶城沙蜥样本信息 序号采样点英文缩写样本量个单倍型多样性（）核苷酸多样性（）且末 民丰 策勒 和田 皮山 叶城 喀什 基因组 的提取 使用通用型基因组 提取试剂盒进行基因组 的提取，并用红色荧光核酸染料染色的 琼脂糖凝胶电泳进行 的完整性和浓度检测，并于放置于 冰柜保存备用。引物筛选及 扩增 试验随机选取 只叶城沙蜥组织作为筛选阶段的材料，根据已发表的沙蜥文献中引物信息及重新设计的叶城引物进行筛选，选出 对南疆沙蜥（、）和新设计的 对叶城沙蜥（、）微卫星引物（表）。反应体系为（）：（）、聚合酶 、荧光标记上游引物 （、）、荧光标记下游引物 、模板 、其余由 补足 。扩增反应条件：预变性；变性，退火，延伸，个循环；变性，退火，延伸，个循环；变性 ，退火 ，延伸 ，个循环；最后 延伸 。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶成像仪上观察结果。将成功扩增的合格 产物送至苏州金唯智生物科技有限公司进行毛细管电泳分析。根据 公布的叶城沙蜥核基因（脑源性神经营养因子，）部分序列（序列号 为），使 用 （）进行引物设计，上游引物：（），下游引物（）。引物由艾科瑞生物（湖南）公司合成。使用设计的引物对叶城沙蜥样本进行扩增。通过试验，建立最佳 扩增体系（）：（）、上下游引物各、模板 、。反应条件：预变性 ；变性 ，退火 ，延伸 ，共循环 次；延伸，保存。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行纯度检测。检测合格的扩增产物由兰州天启基因生物科技有限公司进行测序。表 叶城沙蜥 对微卫星引物信息 位点引物序列（）（）重复序列退火温度（）（）（）（）（）（）数据分析 试验中所得到微卫星数据用对测序仪得到的原始数据进行基因分型分析。用 和 软件分析等位基因数（，）、有效等位基因数（，）、观测杂合度（，）、期 望 杂 合 度（，）、群体间 遗传距离和遗传相似度、群体内近交系数（，）、群体间的遗传分化指数（，）、基因流（，）、多样性指数（）及方差分析（，）。用 软件计 安徽农业科学 年算各位点的多态信息含量（，），并进行哈迪温伯格平衡（，）检验。用 软件绘制基于群体间的 遗传距离的（，）聚类树。试验中所选取的核基因 片段长度在 ，产物测序方式为正反向。采用 （：）处理测序结果原始 文件，经过人工校对后获得 条叶城沙蜥 基因样本，序列长度为。基于核基因 分析叶城沙蜥 个种群的遗传多样性，主要包括单倍型多样性（，）和核苷酸多样性（，）。下载 上已发表的红原沙蜥（）的 全基因（序列号为）作为外群的物种序列。使用 软件构建（）和（）系统发育树，进化树 置信值为重复抽样 次。结果与分析 扩增结果试验筛选出 对多态性高且稳定的微卫星及 对核基因引物，进行后续遗传多样性分析。对选取微卫星引物和核基因引物（其目的条带在 ）在 只样本上进行 扩增（核基因有 样本未成功扩增），采用凝胶电泳检测，目的条带符合预期大小且清晰，核基因序列未提交至，将成功扩增的产物送公司进行测序。以部分样品在引物 和 的电泳结果为例（图），电泳图和测序结果一致，并且能准确读取具体的片段大小。图 微卫星位点（）和核基因（）在叶城沙蜥群体中的部分电泳结果 （）（）遗传多样性分析 对 引物对 个叶城沙蜥群体进行扩增，各位点的平均等位基因数（）和有效等位基因数（）分别为 和 个，平均观测杂合度（）、期望杂合度（）、无偏预期杂合度（）、群内近郊系数（）、群体间分化系数（）和基因流（）分别为、和（表）。个叶城沙蜥群体的等位基因数存在一定差异，其中 最多的为 群体（个），和 群体较少（表）。分析叶城沙蜥种群在微卫星位点的遗传多样性参数，就位点而言，可知 位点上的平均、较高，最低的是在（表）；就种群而言，最高，最低，在杂合度方面，表现出较高的杂合性且有最为丰富的遗传多样性（表）。表 个微卫星位点的遗传多样性 位点 平均值 注：，；，；，；，未测出；，无数值。：，；，；，；，；，基于核基因 对叶城沙蜥 个种群的遗传多样性分析，主要包括单倍型多样性和核苷酸多样性（表）。首先分析单倍型多样性，只蜥蜴中共定义 个单倍型，群体平均单倍型多样性为，群体单倍型多样性范围为 卷 期 谢 慧等 基于核基因和微卫星的叶城沙蜥遗传多样性分析，其中策勒（）单倍型多样性最高，为；叶城（）最低，为。在核酸多样性方面，叶城沙蜥平均核苷酸多样性为 ，核苷酸多样性范围为 ，种群内平均单倍型以策勒（）最高，为 ，叶城（）最低，为 ，表明叶城沙蜥整体遗传多样性为高单倍型多样性和低核苷酸多样性模式。表 个叶城沙蜥种群在 个微卫星位点的遗传多样性参数 位点平均 位点平均 位点平均 位点平均 注：，；，；，；，无数值。：，；，；，；，；，基于微卫星标记的遗传分化。叶城沙蜥 个群体间的 遗传相似度和遗传距离见表。个群体间的遗传距离介于，遗传相似度介于。和 之间遗传距离最短，和 之间的遗传距离最长。表 叶城沙蜥 个群体的遗传距离（下三角）和群体间遗传相似度（上三角）（）（）群体 安徽农业科学 年 基于群体间 遗传距离的聚类树结果（图），个叶城沙蜥种群分为两大类，第一大类包括 和 个种群，其他种群为第二大类。第二大类再分为 个亚类，第 类包括，第类包括 和，第类包括 和。分析结果显示，个群体内的遗传变异占总体变异的。群体间的遗传变异占，分子方差 数据表明的变异大部分存在于群体内，说明这 个群体之间遗传分化较小。图 基于 遗传距离构建的 聚类图谱 基因叶城沙蜥的系统发育分析。基于核基因 系统发育分析，由图 可知，个叶城沙蜥群体样本均在同一大分支，同时、和 聚在同一枝上。红原沙蜥作为外群，独立于另一分支上。基于核基因建成的 进化树，通过计算找到此次最大似然法构建进化树的最佳模型为 ，由图 可知，个叶城沙蜥群体样本均在同一大分支，同时、和 聚在同一枝上，而、和 分别聚在两支上。红原沙蜥作为外群，独立于另一分支上，结果基本一致。讨论 个叶城沙蜥群体遗传多样性 遗传多样性研究是生物多样性研究的重要组成部分，是生物进化和物种分化的基础，研究物种遗传多样性对于评估物种资源状况及在制定野生物种资源保护策略等方面具有重要意义。等位基因数、观测杂合度、期望杂合度和多态信息含量等参数均反映群体遗传基础多样性水平，其值越大，说明基因丰富度越高、生物对环境的适应能力越强。赵丹等利用微卫星标记对我国胎生蜥蜴的 个种群的 只母本和 只子代进行遗传多样性分析，检测到各种群母本和子代的观测等位基因数在。骆爽基于微卫星对西藏高原的 个红尾沙蜥和 个西藏沙蜥样本进行多样性分析，分别检测出 和 个等位基因，平均观测杂合度分别为 和 。该研究利用 对微卫星分子标记对 个叶城沙蜥群体进行遗传多样性分析，发现平均观测杂合度、平均期望杂合度分别为 和。哈迪温伯格平衡检验可以作为衡量群体遗传结构的标准，该研究中，各个群体偏离 平衡，杂合体缺失和无效等位基因的存在是各个群体显著偏离 平衡的原因。该研究的 个叶城沙蜥种群在 个所用的微卫星位点上检测到的平均 值大于，检测到的平均等位基因数高于平均有效等位基因数，说明等位基因分布不匀，比值较大可能是由近交的原因及样本数量不够导致的。衡量群体遗传变异的一个重要参数就是基因杂合度，一般期望杂合度（）越高说明群体的遗传变异越大；观测杂合度（）越接近期望杂合度（），说明群体受外来因素影响越小，处于遗传平衡状态。而基于杂合度计算的近交系数（）可以反映出群体内部的近交程度，它的数值大小反映出了群体中杂合子的缺失或者过剩程度，该研究中表明叶城沙蜥群体间存在一定程度的基因流，这也可以解释基于 构建的 和 进化树中，叶城沙蜥的各种群没有完全独立于一支的原因。核基因在系统发育、生物地理等方面研究的巨大潜力逐渐被发现，由于核基因进化速率相对较慢，能够反映更丰富的生物学信息，因此选择 基因作为研究叶城沙蜥种群进化的分子标记，能够得到更丰富的结果。基于 基因采用邻接法（）和最大似然法（）构建的 种进化树结果