基于曼尼希反应的聚集诱导发光效应用于灵敏检测甲醛_吴金丹.pdf

第 51 卷分析化学（FENXI HUAXUE）研究报告第 2 期2023 年 2 月Chinese Journal of Analytical Chemistry194203DOI:10.19756/j.issn.0253-3820.221482基于曼尼希反应的聚集诱导发光效应用于灵敏检测甲醛吴金丹#曹莹姿#陈凯欣查勇超刘鸿燊周平李楠*（暨南大学生命科学技术学院生物医学工程系，生物材料广东高校重点实验室，广州 510632）摘要甲醛是一类无色无味的致癌物，严重危害人类健康，对甲醛的灵敏检测在环境监测、毒物评估、临床诊断和医疗保健等领域均具有非常重要的意义。本研究合成了具有聚集诱导发光（Aggregation-inducedemission，AIE）效应的荧光探针四羟基四苯基乙烯（Tetra（4-hydroxyphenyl）ethylene，TPE-4OH），在 1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐（1,2,4,5-Benzenetetramine tetrahydrochloride，BTA）存在条件下，TPE-4OH 与溶液中的甲醛分子发生曼尼希反应，从而发生 AIE，引起荧光增强，荧光强度变化与体系中的甲醛水平密切相关，通过测定TPE-4OH 的 AIE 强度可检测水溶液中甲醛浓度。优化了反应物浓度、溶液 pH 值以及反应时间等条件。在最优条件下，本方法检测甲醛的线性范围为 1.02000 mol/L，检出限为 1.0 mol/L。将本方法应用于血清样品中甲醛浓度的检测，回收率为 93.7%106.4%，显示了良好的实际应用价值，为水溶液中甲醛浓度检测提供了一种新方法。关键词 甲醛；荧光检测；聚集诱导发光；曼尼希反应；分子探针甲醛作为一种典型的活性羰基物质，可通过形成稳定的亚甲基桥而使 DNA 和蛋白质交联，进而使其失去活性和功能，因此被认为是一种慢性毒素，可破坏人体神经系统、免疫系统和心血管系统等，甚至致畸、致癌，严重危害人类健康1。长期摄入甲醛可引起支气管哮喘，甚至鼻咽癌和白血病，也可导致新生婴儿畸形，甚至死亡2。甲醛易溶于水，35.0%40.0%甲醛溶液（俗称为福尔马林）具有很强的防腐蚀性，在医学上常用作防腐剂和组织标本固定剂，在农业上用于土壤和种子的消毒杀菌，以及在食品加工方面被非法用于蔬菜水果保鲜、泡发各种水产品及添加于酒水饮料中3-4。水溶液中的甲醛可通过食物摄取等方式进入人体。在细胞色素 P450 酶催化下，内源性甲醛通过脱烷基反应、阿斯巴甜水解和甲醇氧化生成5，也可通过去甲基化酶（如赖氨酸特异性去甲基化酶）和氧化酶（如氨基脲敏感胺氧化酶）反应产生6。甲醛在体内有多种代谢途径，如通过细胞质乙醇脱氢酶还原为甲醇，或通过线粒体醛脱氢酶及细胞质谷胱甘肽依赖型甲醛脱氢酶氧化为甲酸7。内源性甲醛水平异常可导致蛋白质和 DNA 损伤，引起神经退行性疾病，如阿尔茨海默氏症，其患者大脑中内源性甲醛水平升高8。因此，外源性环境污染物与内源性代谢异常过程中微量甲醛检测已引起广泛关注。溶液中甲醛的检测方法主要包括分光光度法9、高效液相色谱法10、气相色谱法11、电化学伏安法12-13、生物传感器法14、荧光探针法15和质谱法11，16等。尽管这些方法能够有效检测甲醛，但仍存在诸如检测过程耗时、样品制备复杂、信号干扰、二次污染、选择性低、灵敏度低以及成本高等问题。因此，开发用于灵敏准确检测溶液中甲醛的新方法具有重要的研究意义和应用价值。聚集诱导发光（Aggregation-induced emission，AIE）现象是指荧光团在单分子状态下几乎没有荧光，在聚集状态下发光效率显著提高，其增强机理归因于受限的分子内旋转或受限的分子内振动现象17-18。AIE 材料具有优良的生物相容性和光稳定性，能够克服传统荧光分子的局限，在化学/生物传感、荧光成像、疾病诊疗等领域展现出良好的应用潜力19。常见的 AIE 分子包括六苯基硅氧烷（Hexaphenylsilole，HPS）、四苯基乙烯（Tetraphenylethene，TPE）、四苯基硅氧烷（Tetraphenylsilole，TPS）衍生物及四苯基吡2022-09-28 收稿;2022-11-23 接受广东省基础与应用基础研究基金项目(No.2020A1515010957)资助。#共同第一作者*E-mail:嗪（Tetraphenylpyrazine，TPP）等20。Pan 等21制备了一种基于 N-苯基咔唑荧光基团的探针（PCBI），此探针在二甲基甲酰胺-水（19，V/V）混合体系中表现出优异的 AIE效应，对肼（N2H4）具有良好的荧光响应，可用于检测水溶液中的 N2H4。Liow 等22开发了一种基于四苯基乙烯共轭聚乙二醇（TPE-PEG2）和-环糊精的主客体复合物，由于 PEG 侧链嵌入环糊精纳米腔中，使得 TPE 分子内旋转受到限制，显示出 AIE 特性，可用作生物成像探针。Li 等23报道了一种含有 TPE 的人造肽荧光探针（TPE-Trp-Pro-Gln-His-Glu-NH2），其细胞渗透性高、生物毒性低、AIE 效应良好，可用于活细胞中 Hg2+的成像检测。目前，已有一些基于AIE 原理检测甲醛的研究报道。Wen 等24设计了一种基于二氨基马来腈的 AIE 探针，利用探针中氨基与甲醛发生反应检测气态甲醛。Zhao 等25开发了一种基于四苯基乙烯的 AIE 探针，通过 2-aza-cope 重排反应实现对气态甲醛的灵敏检测。Li 等26报道了一种基于亲水性肼基萘酰亚胺官能化壳聚糖的聚合物探针，利用甲醛和接枝的肼基-萘酰亚胺基团之间的反应产生 AIE 效应，实现水溶液中的甲醛检测。然而，采用分子结构简单的 AIE 分子探针检测水溶液中甲醛的报道目前还较少。曼尼希反应（Mannich reaction）也称胺（或氨）甲基化反应，是在形成 CC 键的同时可形成 CN 键的有机化学反应。该反应作为合成含氮化合物的重要方法，通常由甲醛和伯胺（或仲胺、氨）与位于羰基官能团旁侧的酸性质子进行氨基烷基化反应，生成-氨基化合物（也称为曼尼希碱），已广泛用于药物和生物碱的合成27。随着对曼尼希反应条件的的研究不断深入，其起始物逐渐多样化，富电子的芳香化合物（如苯酚）作为含活化 CH的化合物也可参与反应28。本研究设计并合成了富含苯酚基团的 AIE 材料四羟基四苯基乙烯（Tetra（4-hydroxyphenyl）ethylene，TPE-4OH），其分子结构简单，但以乙烯键为核心通过单键连接了 4 个含有羟基的苯环，具备了 AIE 分子典型的“螺旋桨”式构型，可有效避免聚集态下的面-面紧密堆积。TPE-4OH 具有多个酚羟基邻位活性位点，可利用富电子苯胺化合物 BTA 含有 4 个苯胺基团的特点，采用 TPE-4OH、甲醛和 BTA 三组分“一锅法”，由溶液中的甲醛与 BTA 的 4 个苯胺基团反应生成亚胺正离子，然后再与 TPE-4OH 的苯酚基团反应形成 CC 键，通过曼尼希反应生成多个曼尼希碱。此外，在甲醛存在条件下，修饰在 TPE-4OH 分子的酚羟基邻位的 BTA 的多个苯胺基团可继续与溶液中相近的其它 TPE-4OH 分子中的苯酚基团发生曼尼希反应，使 TPE-4OH 分子由分散态转变成聚集态，其苯环分子内运动受到限制，从而发生 AIE 效应，使发光强度得到很大提升。当体系中 TPE-4OH和 BTA 浓度一定时，AIE 荧光强度与溶液中甲醛浓度相关，因此，通过测量 AIE 发光强度可实现水溶液中甲醛的定量检测。1实验部分1.1仪器与试剂Nicolet iS50 型傅里叶变换红外光谱仪（美国赛默飞世尔科技公司）；AvanceHD 600M 型核磁共振波谱仪（德国布鲁克公司）；F-7000 型荧光分光光度计（日本日立高新技术公司）。1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐（BTA）、四氢呋喃（THF）、4,4-二羟基二苯甲酮、乙酸乙酯、硫酸奎宁、锌粉（Zn）、K2CO3、TiCl4、MgSO4、H2SO4（北京中科科技股份有限公司）；二甲基亚砜（DMSO，北京鼎国昌盛生物科技有限公司）；二甲亚砜-d6（DMSO-d6，美国剑桥同位素实验室公司）；甲醛、柠檬酸、二水柠檬酸三钠、Na2HPO412H2O（天津大茂化学试剂厂）；NaH2PO42H2O、NaHCO3、Na2CO3（广州化学试剂厂）；胎牛血清（上海麦克林生化有限公司）。所用试剂均为分析纯；实验用水为超纯水（18.2 Mcm）。1.2TPE-4OH的合成参考文献29的方法合成 TPE-4OH。将 TiCl4（0.8 mL，7.0 mmol）和 Zn 粉（0.9 g，14.0 mmol）加入到35.0 mL 无水 THF 中，在氮气保护下回流 2.0 h，再加入 15.0 mL 含有 4,4-二羟基二苯甲酮（1.5 g，7.0 mmol）的无水 THF，混合溶液在氮气保护下继续回流 4.0 h。所得混合物冷却至 25.0，倒入 10.0%K2CO3溶液（50.0 mL）中，剧烈搅拌 5.0 min 后，利用硅藻土垫真空过滤除去分散的不溶性物质。收集有机层，用乙酸乙酯（25.0 mL）萃取水层3次。收集有机相，并用盐水萃取洗涤3次，收集的有机相用无水MgSO4干燥。经旋转蒸发除去有机相，以正己烷-乙酸乙酯（11，V/V）为洗脱液，利用硅胶柱对粗品进行纯化。第 2 期吴金丹等：基于曼尼希反应的聚集诱导发光效应用于灵敏检测甲醛195收集最终的白色产物为 TPE-4OH，产率为 85.0%。1.3探针TPE-4OH检测水溶液中的甲醛取 10.0 mmol/L TPE-4OH 溶液（DMSO 为溶剂）2.0 L 和 100.0 mol/L BTA 溶液 500.0 L，混匀后，加入 100.0 L 不同浓度（1.0、5.0、10.0、20.0、25.0、50.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、350.0、400.0、500.0、1000.0、1500.0 和 2000.0 mol/L）的甲醛溶液，用 pH 6.0 的磷酸缓冲溶液（PBS，1.0 mmol/L）稀释至 1.0 mL，混匀，于室温下孵育 1.5 h。测量相应样品的荧光光谱，平行 3 次实验。激发波长为 290.0 nm，入射及发射狭缝宽度分别为 5.0 和 10.0 nm。2结果与讨论2.1AIE探针的结构表征采用红外光谱、核磁共振波谱（NMR）对合成的 TPE-4OH 分子进行表征。红外图谱如 1A 所示，1608.8 和 1510.6 cm1处的谱峰归于芳香环的 C=C 伸缩振动，829.9 cm1处的谱峰归于苯环的 CH面外变形振动，而另一个峰出现在 3390.7 cm1处，来自酚羟基的伸缩振动。1H NMR 谱（图 1B）中6.736.68（m，2H）和 6.506.46（m，2H）处的峰归因于芳香族质子，而 9.21（s，1H）处的峰为酚羟基的特征峰。13C NMR 谱（图 1C）表明芳香族碳的特征信号在 155.33、137.66、135.04、131.92 和 114.47 ppm处30。这些结果表明成功合成了 TPE-4OH。2.2TPE-4OH分子的荧光特性TPE-4OH分子的荧光性质如图 2A 显示。在 220260 nm 范围内，100.0 mol/L TPE-4OH在 pH 6.0 的PBS 缓冲液中的荧光发射光谱强度随激发波长增加而增大，当激发波长为 260 nm 时呈现最大的荧光强度（图2A 曲线c）；在 280320 nm 范围内，随着激发波长增加，TPE-4OH的荧光发射强度呈大幅下降趋势。因此，TPE-4OH 的最佳激发波长为 260 nm，在该波长激发下，最佳发射波长为 400 nm。如图 2B 所示，TPE-4OH的最佳激发和发射光谱呈对称分布，符合荧光分子的光致激发特征。2.3TPE-4OH对甲醛的荧光响应当 BTA 存在时，考察了 TPE-4OH 的荧光对于甲醛的响应。当溶液中仅存 BTA（图 3A