基于生物信息学分析Scoparone对肝癌的作用机制_杨玉雯.pdf

2023年2月第29卷第2期February.2023 Vol.29 No.2分析基于生物信息学分析Scoparone对肝癌的作用机制*杨玉雯1，姚元谦1，吕建林2，刘英1（1.广西中医药大学，广西南宁530001；2.广西中医药大学第一附属医院，广西南宁530023）摘要目的：研究茵陈活性成分6,7-二甲氧基香豆素（Scoparone）治疗肝癌的分子机制。方法：使用GEO数据库下载肝癌的芯片数据，从TCMSP数据库检索Scoparone的作用靶点，使用R软件获取肝癌差异基因；通过Jvenn和Cytoscape3.9.1软件筛选两者交集靶点，构建蛋白互作网络，进一步使用R软件对核心交集靶点进行GO、KEGG分析；使用AutoDockTools1.5.7及AutoDockVina软件进行分子对接，对活性成分与核心靶点的结合能力进行验证；使用TCGA数据库进行核心基因的生存预后分析。结果：得到肝癌显著性差异基因1 788个、Scoparaone作用靶点100个，筛选出药物-疾病交集靶点97个。PPI拓扑分析得出的核心靶点有JAK1、JAK2、EGFR、ICAM1、KDR等。GO功能富集分析主要涉及氧化应激反应、蛋白质酪氨酸磷酸化及修饰、PI3K级联的正调节等，KEGG通路分析在主要富集在EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药机制、PI3K/Akt信号通路、上皮细胞信号传导通路、Rap1信号通路、Ras信号通路、MAPK信号通路、VEGF信号通路等途径。分子对接验证显示，Scoparone与核心靶点间结合能-5.0 kcal/mol。结论：Scoparone能通过调控JAK1、JAK2、EGFR、ICAM1、KDR等核心靶点，调控PI3K/Akt信号通路、上皮细胞信号传导通路、Rap1信号通路、Ras信号通路、MAPK信号通路、VEGF信号通路等途径，从而抑制肝癌细胞的增殖、侵袭，作用机制涉及氧化应激反应过程、蛋白质酪氨酸磷酸化及修饰、ATP结合等生物功能。关键词肝癌；6,7-二甲氧基香豆素；茵陈；GEO芯片挖掘；TCGA数据库；分子对接中图分类号R285.5文献标识码A文章编号1672-951X（2023）02-0127-06DOI：10.13862/43-1446/r.2023.02.026Analysis on the Mechanism of Action of Scoparone in Liver Cancer Based onBioinformaticsYANG Yuwen1,YAO Yuanqian1,LYU Jianlin2,LIU Ying1(1.Guangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanning Guangxi 530001,China;2.The First AffiliatedHospital of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanning Guangxi 530023,China)AbstractObjective:To study the molecular mechanism of 6,7-dimethoxycoumarin(Scoparaone),the activeingredient of Inoceramus,in the treatment of liver cancer.Methods:Microarray technology for hepatocellularcarcinoma was downloaded with the GEO database.The action targets of Scoparone was retrieved from theTCMSP database.The hepatocellular carcinoma differential genes were obtained by R software.The intersectiontargets of both were screened by Jvenn and Cytoscape 3.9.1 software to construct protein interaction networks.GO and KEGG analysis were further performed on the core intersection targets by R software.AutoDockTools1.5.7 and AutoDockVina software were used to perform molecular docking and the binding ability of the activeingredient,in order to verify the core targets.The survival and prognosis of core genes were analyzed withTCGA database.Results:Totally 1 788 genes with significant differences in liver cancer,and 100 Scoparaoneaction targets were obtained.A total of 97 drug-disease intersection targets were screened.The core targets引用：杨玉雯，姚元谦，吕建林，刘英.基于生物信息学分析Scoparone对肝癌的作用机制J.中医药导报,2023,29(2):127-132.*基金项目：国家自然科学基金项目（81860839）；广西自然科学基金项目（2020GXNSFAA238020）；广西自然科学基金项目（2022GXNSFAA035446）通信作者：吕建林，E-mail：1272023年2月第29卷第2期February.2023 Vol.29 No.2肝癌是我国第四位常见恶性肿瘤，也是我国第二位肿瘤致死病因，严重威胁我国人民的生命和健康1。其中肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）占75%85%2。目前临床上根治肝癌的方法主要为消融治疗、手术切除及肝移植3种方法3。因肝脏表面缺乏痛觉末梢神经，肝癌早期往往难以发现，而发现时已超出可接受外科手术治疗的阶段，故能接受外科手术治疗的肝癌患者只有约20%。且肝癌发生、发展的分子机制目前尚未完全清楚，因此临床治疗原发性肝癌应重视多学科治疗模式。6,7-二甲氧基香豆素（Scoparone）为中药茵陈的活性物质。在体外实验中Scoparone可通过干预PI3K/Akt信号通路抑制癌细胞增殖、抑制癌细胞迁移和侵袭，并能诱导细胞周期停滞和凋亡4。有研究表明，Scoparone在对大鼠急性药物性肝损伤模型具有保护作用5。炎症反应在诱导肝细胞发生恶性转化和促进肿瘤细胞异常增殖、恶性增长的过程中有着重要作用。但目前对于Scoparone在肝癌发生发展中的作用及其作用机制尚缺乏深入的认识。故本研究通过GEO数据库、TCMSP数据库、TCGA数据库等生物信息学平台研究Scoparone治疗肝癌的潜在靶点，使用分子对接技术对其进行验证，并使用R软件进行GO和KEGG通路富集，从而分析Scoparone治疗肝癌的作用靶点及调控途径。1材料与方法1.1下载GEO芯片数据获取肝癌靶点以“liver cancer”为关键词，在GEO数据库（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中检索相关芯片基因，获取GSE84402芯片数据集。该数据集包含14例配对的肝细胞癌肿瘤组织与正常癌旁肝组织，公开日期：2017年9月14日。利用R软件对芯片数据进行分组，应用“lima”“pheatmap”“ggplot2”包，以|lgFC|1、校正P值0.05为筛选条件，获取与肝癌相关的显著差异基因，分别选取所有差异基因绘制火山图，并选取上调基因与下调基因中的前20个基因绘制热图。1.2获取Scoparone的药物作用靶点在PubChem数据库（https:/pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载Scoparone的2D Structure数据文件，将2D Structure数据上传至SwissTargetPrediction数据库（http:/www.swisstargetprediction.ch/）进行药物靶点预测。1.3获取交集基因将“1.1”“1.2”项中检索得到的Scoparone的药物作用靶点和肝癌差异基因导入Jvenn软件，绘制Venn图并获取交集靶点。1.4建立蛋白互作网络（PPI）并分析将交集靶点提交至STRING平台（https:/string-db.org/）获取PPI蛋白互作网络，下载该网络的TSV格式文件并导入Cytoscape 3.9.1进行拓扑分析，通过Cytoscape中的MCODE插件，根据其连接紧密程度进行评分并筛选出Scoparone治疗肝癌的核心靶点，并绘制蛋白互作（PPI）网络图。1.5GO生物功能和KEGG通路富集分析采用R软件将核心靶点的基因名称转换为ENTREZID，并用Bioconductor包，以P0.05为筛选条件，对数据进行基因功能和信号通路富集可视化分析6。将GO、KEGG富集结果导入Cytoscape 3.9.1可视化软件，构建差异基因“靶点-通路”网络。1.6分子对接将Scoparone作为小分子配体，选取“1.4”项中连接紧密度最高，且是“1.5”项中的前4个核心靶点作为蛋白受体。在TCMSP数据库中下载Scoparone mol2格式的化学结构，从PDB数据库（http:/www.rcsb.org/）获取核心靶点的蛋白质结构，用PyMOL软件去除蛋白质结构上原有的水分子、蛋白质配体等结构。再运用AutoDockTools 1.5.7及AutoDockVina软件进行分子对接，其结果以受体和配体结合自由能分数高低作为结合程度的评价标准。结合能越低，结合越稳定。1.7关键基因的生存预后分析通过UCSC Xena在线网站（https:/xena.ucsc.edu/）和TCGA临床数据库，选择疾病特异性生存期作为对应生存时间，分析关键基因表达量对肝癌患者预后生存的影响，并绘制生存曲线。2结果2.1肝癌GEO芯片差异基因分析通过GEO数据库对肝癌患者和正常对照组的基因芯片进行分析，共获取了1 788个差异基因，其中上调基因773个，下调基因1 015个。将1 788个差异基因使用ggplot2包绘制火山图。（见图1）选取上调基因与下调基因中的前20个基因使用pheatmap绘制热图。（见图2）derived from PPI topology analysis include JAK1,JAK2,EGFR,ICAM1,KDR,etc.GO functional enrichmentanalysis mainly involved oxidative stress response,protein tyrosine phosphorylation and modification,positiveregulation of PI3K cascade,etc.The KEGG pathway analysis was mainly enriched in EGFR tyrosine kinaseinhibitor resistance mechanism,PI3K/Akt signaling pathway,epithelial cell signaling pathway,Rap1 signalingpathway,Rassignalingpathway,MAPKsignalingpathway,VEGFsignalingpat