基于生物信息学分析EDIL...在宫颈癌中的表达及临床意义_王慧娟.pdf

第 卷 第 期 年 月石河子大学学报（自然科学版）（）收稿日期：基金项目：国家自然科学基金项目（，）；新疆生产建设兵团国际科技合作计划基金项目（）；石河子大学科研基金项目（）作者简介：王慧娟（），女，硕士研究生，主管技师，专业方向为人体重要功能蛋白的克隆与基因工程。通信作者：潘泽民（），男，教授，博士生导师，从事人体重要功能蛋白的克隆与基因工程的研究，：。：.文章编号：（）基于生物信息学分析 基因在宫颈癌中的表达及临床意义王慧娟，郭炳轩，宋树言，李杨杨，者湘漪，李洪涛，李冬妹，潘泽民（石河子大学医学院第一附属医院检验科，新疆 石河子；石河子大学医学院生物化学教研室 新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，新疆 石河子；石河子大学医学院人体解剖学与组织胚胎学教研室，新疆 石河子）摘要：目的 探讨表皮生长因子样重复序列和盘状蛋白 样结构域（基因）在宫颈癌中表达及其对宫颈癌细胞、迁移的作用。方法 运用、数据库分析 基因 在宫颈癌组织中的表达水平、基因启动子甲基化状态和预后的意义；采用免疫组织化学染色、分别检测宫颈癌组织和细胞中 蛋白及 基因 表达水平；构建.过表达质粒，转染分为实验组（转染过表达.质粒）和对照组（转染空质粒），实验检测宫颈癌细胞、的迁移。结果 生物信息学数据库分析显示 基因 在宫颈癌组织中低表达并且存在启动子高甲基化（.），在宫颈癌不同分期中 基因的表达无差异（.），高表达与宫颈癌患者不良预后相关（.）；免疫组织化学染色、与数据库分析结果一致，在宫颈癌组织和细胞中 基因均低表达（.），且其表达水平与 感染无明显相关性（.）；实验显示过表达 后增强宫颈癌细胞、的迁移能力（.）。结论 基因在宫颈癌组织和细胞中低表达并不受 感染的影响，而 高表达影响患者预后且促进宫颈癌细胞 、的迁移能力。关键词：宫颈癌；基因；迁移中图分类号：.文献标志码：，（，；，；，）：（），.（）（石河子大学学报（自然科学版）第 卷）（.），（.）（.），（.），（.）（.），：；宫颈癌是一种在临床中非常常见的女性生殖道癌症，也是不发达国家和地区因癌症而死亡的最常见的原因之一。刚刚发布的 年世界癌症报告分析了中国癌症病例的变化和特点，新增宫颈癌患者 万例，因宫颈癌病死 万例。研究发现宫颈癌发生的重要原因包括高危型人乳头瘤病毒（，）持 续 性 感 染，如、和，虽然针对高危型 研发了疫苗，但接种疫苗的人员并没有普及，特别是一些不发达地区的女性。现如今临床治疗宫颈癌主要采用免疫和手术等综合治疗方法，但很大一部分患者生存率依然很低，因此迫切需要探索诊治宫颈癌的新策略、新方向和新靶点。表皮生长因子样重复序列和盘状蛋白 样结构域（，）又称为发育内皮基因座（，），位于人染色体，分子量为 ，全长约 ，是一种细胞外基质蛋白，早期在小鼠胚胎中发现，亦是一种由胚胎内皮细胞分泌的糖蛋白。编码的蛋白质是整合素配体，通过与整合素 相互作用促进新血管的生长。在结直肠癌和肺腺癌中表达下调，相反，其在乳腺癌、胰腺癌中表达水平增加，并与疾病预后不良相关。至今为止，尚未见 基因在宫颈癌中作用研究的相关报道，因此本研究探讨 基因在宫颈癌中的表达情况及临床意义，旨在为宫颈癌的预防和诊治提供有价值的基础研究和临床指标。材料与方法.细胞与试剂 实验选取购自武汉普诺赛生命科技公司的宫颈癌细胞株、和人宫颈上皮永生化细胞株 作为研究对象。实验所用试剂有美国 公司生产的培养基（）和胎牛血清（）；北京中山金桥公司生产 鼠单克隆抗体；美国 公司生产的 转染试剂；兔单克隆抗体 购自武汉三鹰生物技术有限公司；小室购自美国 公司；.过表达质粒由上海吉玛制药技术有限公司合成。.数据来源.（）数据库 在线应用数据库（：）是北京大学各级专家精心研制开发的一款软件，目前已更新到.版本。该数据库含有 和 个数据库中正常组织样本 个和肿瘤样本 个，在正常组织和肿瘤组织中用以分析某基因的表达差异性、预后及相关性等。该在线工具在本研究中主要挖掘 在宫颈癌及正常宫颈组织中的 表达差异。筛选条件如下：；，：，：；，其余条件不变；分析宫颈癌不同分期中的基因表达。.数据库 数据库（：）主要建立在肿瘤基因组图谱 数据库的基础上用于对某基因的表达谱、启动子甲基化情况、鉴定、相关性、泛癌表达及预后等相关癌症数据进行分析。本研究应用该数据库对 基因启动子甲基化状态进行了分析。筛选条件如下：”，”；：”。第 期王慧娟，等：基于生物信息学分析 基因在宫颈癌中的表达及临床意义 .数据库 数据库（）包括了 数据库中 个病人的 种肿瘤的临床信息、生存信息及对应的 和 的表达谱数据和来源于 项目中 的表达谱数据，因此该数据库囊括了、和 种转录本的生存分析，使用户探索研究肿瘤中和生存分析相关的基因更加便利。筛选条件如下：，；选择宫颈癌（），点击 提交；在新弹出的页面中定义 值（一般用中位数定义分组，即），后就能看到 生存图和 值了；点击 下载 格式的原始数据，使用 软件计算.时的 值，重新分析结果。.实验方法.细胞培养复苏液氮中冻存的细胞后将、细胞培养于含 的 和 的双抗（青、链霉素）的 中，细胞培养于含 的 和 的双抗的 中，细胞培养箱条件为 、。用胰蛋白酶消化对数期的细胞 并 传代，连续传三代后进行后面的实验。.细胞转染取 细胞铺板，培养 弃去 孔板中培养基后用 洗涤两遍，加入 备用。配置 液：过表达质粒；液：空质粒；液 份：，静置 后，将 液与一份 液混匀，液与另一份 液混匀后共同静置 不要移动，然后将混合液 和 分别散在均匀滴入上面备用 孔板细胞中，后换完全培养基，后进行细胞计数铺板。细胞转染步骤同上。.实验检测细胞中 基因 的表达水平 将处于对数期状态的细胞使用 提取总，然后把提取到的 逆转录为 放入低温冰箱备用。以 为模板进行扩增（预变性 ，个循环）。使用实验室 型 仪自带软件分析及获取循环阈值，最后使用公式 计算细胞 的相对表达量。.实验检测细胞中 蛋白质的表达水平 在处于对数生长期的细胞皿中加入 裂解液放入冰箱裂解 ，待细胞呈流沙状态完全裂解后用刮刀将全部细胞刮入 管中备用，离心 。吸取部分蛋白按比例加入 后煮沸（，）放入冰箱冰冻储存，剩余 使用 试剂测定其浓度。用 （后 ）分离 蛋白后湿转（，）至 膜上，加入雀巢脱脂奶粉封闭（，常温，）后孵育一抗（，）过夜杂交，洗涤 次后孵育二抗（，室温，）。洗涤 次后由 公司的 化学发光仪曝光条带及使用 软件测定各条带灰度值。目的蛋白质的相对表达量目的蛋白质条带灰度值内参 蛋白质条带灰度值。.免疫组织化学方法检测组织中 蛋白质表达水平 选取本校第一附属医院收治的宫颈癌患者石蜡包埋的组织样本 例及炎症患者石蜡包埋的组织样本 例，实验获得医院伦理委员会的批准及患者的知情同意。使用第二代杂交俘获（，）技术检测所收集诊断为宫颈癌疾病的样本的 感染的情况，所有组织样本严格按照免疫组织化学染色实验操作步骤进行染色。抗体浓度为 。使用半定量计分法判断 阳性表达：阳性细胞数大于 为 分，为 分，为 分，为 分，小于 为 分在高倍镜视野下根据显色强度判断阳性强度：棕褐色为 分，棕黄色为 分，黄色为 分，无阳性细胞为 分。求取上述两项得分乘积：分为阴性（），分为弱阳性（），分为中阳性（），分为强阳性（）。本实验取阴性和弱阳性归一为阴性，中阳性和强阳性归一为阳性，结果由医院病理科两名副主任医师以上以双盲法独立确定。.体外实验检测、细胞迁移能力 取两组 细胞（过表达 组和对照组），用胰蛋白酶消化后离心弃上清液使用 清洗 遍，加入无血清 制成细胞悬液进行计数以调整细胞浓度为，孔板中每孔加入含 总量为 的，用镊子轻轻将 小室放入培养基中（避免产生气泡），吸取 配置好的悬液梅花式点入 小室的上室，不要摇动放入条件为 、的 培养 石河子大学学报（自然科学版）第 卷箱进行培养。后用 分别清洗小室的上、下室两次后使用 多聚甲醛固定 半小时及.的结晶紫室温孵育半小时，最后用清水轻柔洗涤 遍后使用干净棉签轻轻擦去小室内未迁移的细胞，在显微镜下随机拍 个高倍镜视野进行计数。细胞迁移实验同上。.统计学方法本次研究所有数据均重复实验 次并使用统计学软件 .进行分析，计量实验数据以表示。采用 检验比较两组实验结果的差异，卡方检验 用 于 石 蜡 切 片 免 疫 组 织 化 学 结 果 分 析，相关系数检验分析两者的相关性，.为差异具有统计学意义。结果.生物信息学数据库预测宫颈癌组织中 基因 表达水平 根据 数据库预测 基因 在宫颈癌组织中的表达水平，结果显示与正常宫颈组织相比较，基因 在宫颈癌组织中低表达（.），在宫颈癌不同分期中的基因表达无差异（.）（图）。图 数据库预测宫颈癌组织中 基因 表达水平.生物信息学数据库分析宫颈癌组织中 基因启动子甲基化状态 使用 数据库预测 基因启动子甲基化在宫颈癌组织中的水平，结果显示 基因启动子在宫颈癌组织中高甲基化，.，差异具有统计学意义（.）（图）。图 数据库分析宫颈癌组织中 基因启动子甲基化状态.生物信息学数据库分析 基因表达水平与宫颈癌预后的关系 数据库选取患宫颈癌疾病 例病人分析其预后，其中 例患者 高表达和 例患者 低表达。结果显示 高表达的宫颈癌患者生存率较低表达的宫颈癌患者低，预后不良，（.）（图）。图 数据库预测 表达水平与宫颈癌患者生存率的关系第 期王慧娟，等：基于生物信息学分析 基因在宫颈癌中的表达及临床意义 .免疫组织化学分析 在宫颈癌组织中的表达水平 采用免疫组织化学分析宫颈组织样本中 蛋白质表达水平，检测到 定位在细胞质中（图）。染色结果统计显示与正常宫颈组织相比，在宫颈癌组织中低表达（.）（表）。图 在宫颈组织中的表达情况表 在宫颈组织中染色结果统计组织类型阴性阳性总计正常宫颈组织宫颈癌组织.注：卡方检验，.。.蛋白质印迹法和实时荧光定量 分析 在宫颈癌细胞中的表达水平 采用 和 分别对宫颈细胞中 蛋白质和 表达水平进行分析。统计结果显示 蛋白质和 的表达水平在、中相对 较低（.）（图）。.蛋白质表达与 感染的相关性分析 综合前期收集的组织样本 检测结果，再结合免疫组织化学染色的统计结果进行相关性分析，结果表明 蛋白表达与 感染无明显相关性（.）（表）。图 在 种宫颈细胞中的表达情况表 表达与 感染的相关性类型总计 值 阴性 阳性.注：相关系数检验，.。.实验分析过表达 对宫颈癌细胞迁移能力的影响 基于以上实验结果，我们在宫颈癌细胞、中转染了过表达 质粒，计数铺板后 小时分别计数对照组 和过表达 组穿膜细胞数，结果显示过表达 组穿膜细胞数多于对照组，差异具有统计学意义（.）（图）。讨论 宫颈癌由鳞状细胞癌和腺癌两种主要组织型组成，占宫颈癌的比例分别为 和 。宫颈癌的发病率和病死率在世界各国女性最常见的癌症类型中继乳腺癌、结直肠癌和肺癌之后排名第四。流行病学研究报告显示，多数宫颈癌病例都与高危型的 持续感染高度相关，大约的肿瘤与之无关，尤其是腺癌。迄今为止，、和 在我国是最常见的高危型 亚型，在新疆，尤其是维吾尔族女性中与宫颈病变进展关系最密切的两种亚型 和 的致癌强度最强，容易整合入宿主细胞 中，术后清除率低于其他亚型，宫颈癌是一种可预防和治疗的疾病，通过了解宫颈癌发生发展的机制和确定其早期诊断的潜在生物标志物可有效缓解病情，提高患者的生存率，生物信息学数据库的出现，为宫颈癌的发生发展机制及验证上下游关系的研究提供了理论知识。，血管内皮生长因子超家族成员之一，是 石河子大学学报（自然科学版）第 卷图 实验检测、细胞迁移能力一种在早期胚胎内皮细胞中表达的血管生成因子，亦是一种整联蛋白配体，通过与整联蛋白受体 相互作用阻止细胞凋亡和促进内皮细胞粘附，在介导血管生成中发挥非常重要的作用。越来越多的研究报道了 在癌症中的作用，在肝细胞癌中，高表达 的患者预后较差，实验数据表明 是肝细胞癌抗血管生成治疗的潜在靶点。在三阴性乳腺癌中，是 和 的直接靶点，过表达 通过干扰 的表达水平抑制乳腺癌细胞 的增殖侵袭和迁移能力。在胃癌中，表达增加，且干扰 表达可以抑制裸鼠肿瘤生长，证明了 调