大鼠三叉神经病理性疼痛致病关键转录分子分析_刘玥旻.pdf

收稿日期 2021-09-02；修回日期 2021-12-10基金项目上海市科委生物医学创新研究专项（21Y11903500）；上海交通大学医学院附属第九人民医院罕见病注册登记项目（JYHJB202204）；上海交通大学医学院附属第九人民医院临床研究型MDT项目（201701018）作者简介刘玥旻(1996-)，女，在读硕士研究生，E-mail:通信作者陈敏洁，E-mail:chenmj_c2023年版权归上海口腔医学编辑部所有大鼠三叉神经病理性疼痛致病关键转录分子分析刘玥旻，柴盈，魏文斌，刘芷扬，韩孜祥，陈敏洁（上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔外科，上海交通大学口腔医学院，国家口腔医学中心，国家口腔疾病临床医学研究中心，上海市口腔医学重点实验室，上海市口腔医学研究所，上海200011）摘要目的：分析三叉神经病理性疼痛致病关键转录分子，筛选参考三叉神经痛发病的关键分子。方法：构建大鼠三叉神经病理性疼痛模型，即眶下神经慢性缩窄环模型（chronic constriction injury of distal infraorbital nerve,IoN-CCI），观察动物行为并收集三叉神经节进行RNA-seq转录组学分析。采用StringTie对基因组表达进行注释和定量，进一步计算基因和转录本的FPKM。使用DESeq2进行组间比较，设置筛选条件为P0.05和差异倍数（fold change）2及0.5，筛选差异基因，采用火山图和聚类图进行展示。应用clusterProfiler软件对差异基因进行GO功能富集分析。结果：术后第5天（POD5），大鼠抓挠面部行为上升达到峰值；术后第7天（POD7），von-frey值降到最低，提示大鼠机械痛阈值明显下降。RNA-seq分析IoN-CCI大鼠神经节，发现显著上调的信号通路包括B细胞受体信号通路、细胞黏附、补体及凝血级联通路；显著下调通路为系统性红斑狼疮相关调控通路；Cacna1s、Cox8b、Myl1、Ckm、Mylpf、My-oz1和Tnnc2等多个基因参与介导三叉神经痛的发生。结论：B细胞受体信号通路、细胞黏附、补体及凝血级联通路、神经免疫通路与三叉神经痛的发生密切相关。Cacna1s、Cox8b、Myl1、Ckm、Mylpf、Myoz1和Tnnc2等多个基因的相互作用，导致三叉神经痛发生。关键词三叉神经痛；转录组测序；神经病理性疼痛中图分类号 R782.4文献标志码 ADOI:10.19439/j.sjos.2023.01.007Analysis of potential pathogenic factors of trigeminal neuralgia in ratsLIU Yue-min,CHAI Ying,WEI Wen-bin,LIU Zhi-yang,HAN Zi-xiang,CHEN Min-jie.(Department of Oral Surgery,Shanghai Ninth Peoples Hospital,ShanghaiJiao Tong University School of Medicine;College of Stomatology,Shanghai Jiao Tong University;National Center forStomatology;National Clinical Research Center for Oral Diseases;Shanghai Key Laboratory of Stomatology;ShanghaiResearch Institute of Stomatology.Shanghai 200011,China）Abstract PURPOSES:Transcriptomics-based analysis of key transcriptional molecules in the pathogenesis of trigeminalneuropathic pain was conducted to screen key molecules in the pathogenesis of trigeminal neuralgia.METHODS:Rattrigeminal nerve pathological pain model,namely chronic constriction injury of distal infraorbital nerve(IoN-CCI),wasconstructed and animal behaviors postsurgery were observed and analyzed.Trigeminal ganglia were collected for RNA-seqtranscriptomics analysis.StringTie was used to annotate and quantify genome expression.DESeq2 was applied to comparebetween groups with P value less than 0.05 and fold change greater than 2 times and less than 0.5 times to screen differ-ential genes,and display them with volcano graphs and cluster graphs.ClusterProfiler software was used to perform GOfunction enrichment analysis of differential genes.RESULTS:On the fifth postoperative day(POD5),the rats face-grooming behavior increased to a peak;on the seventh postoperative day(POD7),the von-frey value dropped to the lowestvalue,indicating that the mechanical pain threshold of rats was significantly decreased.RNA-seq analysis of IoN-CCI ratganglia found that the significantly up-regulated signaling pathways included B cell receptor signaling pathway,cell adhe-sion,complement and coagulation cascade pathways;significantly down-regulated pathways were related to systemic lupuserythematosus.Multiple genes among Cacna1s,Cox8b,My1,Ckm,Mylpf,Myoz1,Tnnc2 were involved in mediating the上海口腔医学2023年2月 第32卷第1期Shanghai Journal of Stomatology Vol32 No1 February,202333occurrence of trigeminal neuralgia.CONCLUSIONS:B cell receptor signaling pathway,cell adhesion,complement andcoagulation cascade pathways,neuroimmune pathways are closely related to the occurrence of trigeminal neuralgia.Theinteraction of multiple genes among Cacna1s,Cox8b,My11,Ckm,Mylpf,Myoz1,Tnnc2 leads to the occurrence of trigemi-nal neuralgia.Key words Trigeminal neuralgia;RNA-Seq;Neuropathic painShanghai J Stomatol,2023,32(1):33-39.三叉神经痛（trigeminal neuralgia，TN）是一种常见的颌面部神经病理性疼痛，患病率为0.03%0.3%，发病年龄集中在3767岁1；临床表现为阵发性、针刺样或烧灼样剧烈疼痛，严重影响患者的工作和生活质量，甚至导致患者轻生2。由于三叉神经病理性疼痛具有危害性大、难以治愈的特点，对其发病机制的深入研究意义重大。回顾国内外相关文献，TN的致病机制有以下假说：中枢性假说、神经压迫、炎症反应、生物共振和离子通道改变假说等3-4，其中以血管压迫假说最为流行，微血管压迫导致机械性损伤，使三叉神经根中的感觉轴突发生脱髓鞘改变，相邻轴索纤维伪突触形成或短路，轻微痛觉刺激通过短路传入中枢，中枢传出冲动亦通过短路传入，如此叠加造成疼痛发作5-6。三叉神经节（trigeminalganglion，TG）又称为半月神经节（casserian ganglia，CG），是口腔颌面部痛觉传入的第一级神经元，既具有感觉传入功能，又能对感觉伤害性剌激的外周神经末梢的兴奋加以调控7-8。因此不少学者认为，TG神经元细胞与神经病理性疼痛发病的调控密切相关。转录组测序（RNA-seq）能够利用高通量测序技术，从基因表达水平揭示疾病发生的可能分子机制，同时筛选出具有重要研究意义的新基因。转录组能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，已广泛用于多种疾病发病机制的研究9-10。本研究对颌面部神经病理性疼痛造模大鼠的三叉神经节进行转录组测序，分析疼痛发病相关的基因表达谱，为靶向治疗研究提供新的思路。1材料与方法1.1实验动物选择雄性SD大鼠，体重200 g左右，6周龄，由北京维通利华实验动物公司提供。将大鼠随机分为正常对照组（NC）6只、假手术组（sham）6只和手术组24只。手术组再分为：术后1、3、5、7、14和21天。在12 h明暗循环（照明时间06:0018:00）的动物饲养所中饲养，湿度为50%60%，可自由获得饲料和水。实验动物在术前1周适应环境。1.2构建大鼠眶下神经慢性缩窄环模型（chronicconstriction injury of distal infraorbital nerve,IoN-CCI）腹腔注射戊巴比妥(60 mg/kg,i.p.)，将大鼠麻醉，在不损伤胡须的情况下轻轻剃掉大鼠眼睛和胡须垫之间的毛发。将大鼠放在加热垫上以保持体温，双眼涂抹凡士林，防止干燥造成的损伤。用75%乙醇棉球消毒术区，从第三排触须尾端开始平行于中线切开一个0.5 cm的切口，朝向同侧眼眶。钝性分离浅筋膜，暴露眶下神经干（infraorbital nerve，IoN）远端部分11。用2条4-0丝线，松散地绑IoN的远端部分（相距2 mm），使神经直径缩小但不影响表面的血运循环12。1.3伤害性疼痛实验将大鼠置于网笼中，等待适应环境，保持安静状态。使用von Frey纤维丝刺激大鼠的手术侧胡须。从最小刺激强度0.008 g开始，逐渐增加，直至大鼠出现退缩回避、攻击性和不对称抓脸行为，视为阳性反应。每个刺激强度测试3次/侧，3次测试中2次出现阳性反应，则对应的纤维丝强度记为大鼠的机械痛阈。若刺激强度为1.4 g，大鼠仍无上述阳性反应，则停止实验，以1.4 g作为实验阈值11。实验时间包括手术前和手术后1、3、5、7、14天5个时间点。将大鼠放入透明玻璃外壳中，拍摄10 min内抓挠面部次数（face-grooming）的视频并进