大豆E3泛素连接酶基因Gm...物信息学分析和敲除载体构建_王昕.pdf

大 豆 科 学 Soybean Sciencehttp:/ddkx haasep cn2023，42(2):165-174DOI:10 11861/j issn 1000-9841 2023 02 0165大豆 E3 泛素连接酶基因 GmHOS1a 和 GmHOS1b 生物信息学分析和敲除载体构建王昕1，2，李聪1，3，许志永1，4，刘斌1，赵涛1，刘军1，李宏宇1(1 中国农业科学院 作物科学研究所，北京 100081;2 山东省德州市农产品质量检测中心，山东 德州 253000;3 广东省科学院 南繁种业研究所，广东 广州 510316;4 黑龙江省金色北农种业科技有限公司，黑龙江 哈尔滨 150028)摘要:HIGH EXPESSION OF OSMOTICALLLY ESPONSIVE GENES 1(HOS1)是植物中多种信号途径的整合因子，在植物发育、胁迫反应、光形态建成和开花调控中发挥至关重要的作用，是很有潜力的作物工程育种目标基因，但其在大豆中的功能尚未被揭示。为了揭示其在大豆中的功能，本研究利用反向遗传学，成功克隆了两个大豆 HOS1 基因，GmHOS1a 和 GmHOS1b，并通过生物信息学技术，对其蛋白结构、表达模式和功能进行了分析。进化树和结构域分析表明，GmHOS1a 和 GmHOS1b 具有 N 端的环指结构域和与 ELYS 高度相似的保守基序，与拟南芥和水稻 HOS1 蛋白高度同源。亚细胞定位结果显示，GmHOS1a 和 GmHOS1b 定位在细胞核中。Quantitative eal-time PC(qT-PC)结果表明，GmHOS1a 和 GmHOS1b 的基因表达模式相似，均在三出复叶中高度表达。48 h 光周期 NA-sequencing(NA-seq)和 qT-PC 分析表明，GmHOS1a 和 GmHOS1b 基因的表达具有生物钟昼夜节律性，其中 GmHOS1a 的表达量显著高于 GmHOS1b，GmHOS1a 见光后表达量升高，黑暗前表达量达到峰值。为进一步探索 GmHOS1a 和 GmHOS1b蛋白的功能，利用 CISP/Cas9 系统构建了 9 个 GmHOS1a 和 GmHOS1b 基因敲除载体，通过发根检测实验，筛选出 6个高效工作载体，可供后续遗传转化实验使用。本研究为阐明该基因的功能和作用机理奠定了理论基础，并提供了可供遗传转化的载体材料。关键词:大豆;GmHOS1s;CISP/Cas9;E3 泛素连接酶;亚细胞定位;生物钟收稿日期:2022-11-16基金项目:国家自然科学基金(32072091);湛江市领航计划项目(211207157080997)。第一作者:王昕(1994)，女，硕士研究生，主要从事生物化学与分子生物学研究。E-mail:WX940709163 com。通讯作者:李宏宇(1970)，女，博士，研究员，主要从事植物分子生物学与基因工程研究。E-mail:lihongyu caas cn。Bioinformatics Analysis and Knockout Vector Construction of Soybean E3Ubiquitin Ligase Gene GmHOS1a and GmHOS1bWANG Xin1，2，LI Cong1，3，XU Zhi-yong1，4，LIU Bin1，ZHAO Tao1，LIU Jun1，LI Hong-yu1(1 Institute of Crop Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China;2 Shandong Dezhou Agricultual Product QualityInspection Center，Dezhou 253000，China;3 Institute of Nanfan Seed Industry，Guangdong Academy of Sciences，Guangzhou 510316，China;4 Heilongjiang JSBN Seed S T Co，Ltd，Harbin 150028，China)Abstract:HIGH EXPESSION OF OSMOTICALLLY ESPONSIVE GENES 1(HOS1)is an integration factor of severalsignaling pathways in plants，it plays important roles in processes such as growth and development，stress response，photomorphogenesis and flowering time regulation etc，but its function in soybean has not been revealed By using reversegenetics，we cloned two HOS1 homologous genes in soybean，GmHOS1a and GmHOS1b，and analyzed their protein structures，expression patterns and functions by bioinformatics analysis Through phylogenetic analysis，we found that GmHOS1a andGmHOS1b are highly conserved to Arabidopsis and rice HOS1 proteins，both of which have N-terminal ring finger domain andconserved motif ELYS-like This suggests that GmHOS1a and GmHOS1b may have similar functions to Arabidopsis HOS1However，subcellular localization showed that GmHOS1a and GmHOS1b proteins were only localized in the nucleus，whichwas different from that of Arabidopsis HOS1 protein Therefore，we speculated that the action mode of GmHOS1a andGmHOS1b may be different from that of Arabidopsis Further analysis showed that the expression patterns of GmHOS1a andGmHOS1b were similar，the highest expression of GmHOS1a and GmHOS1b exited in trifoliate leaves，followed by flowers andsingle leaves The expression pattern of GmHOS1a and GmHOS1b were rhythmically The expression of GmHOS1a increasedafter exposure to light and reached a peak before darkness These results suggest that GmHOS1a and GmHOS1b in soybeanmay be involved in the regulation of circadian rhythm To further explore the function of GmHOS1a and GmHOS1b，weconstructed nine knockout vectors of GmHOS1a and GmHOS1b using CISP/Cas9 system，and screened out six efficientvectors through hair root experiments，which will be used in the future soybean genetic transformation This study provides atheory basis for exploring the function of GmHOS1a and GmHOS1b，and provides vector materials for further genetic analysisKeywords:soybean;GmHOS1s;CISP/Cas9;E3 ubiquitin ligase;subcellular localization;biological clock大豆是人类食用油和蛋白质的主要来源，我国是世界大豆需求量最大的国家之一。大豆是典型的短日照植物，光照和温度是制约大豆适应性和推广的重要因素，如何提高大豆的单产和抗逆性是大166大 豆 科 学2 期豆亟待解决的问题。通过对大豆关键基因功能的研究，尤其是对影响多个调控通路的关键基因功能及调控网络的解析可为解决大豆的产量和抗逆提供 理 论 和 应 用 支 持。在 植 物 发 育 过 程 中EXPESSIONOFOSMOTICALLLYESPONSIVEGENES 1(HOS1)参与调控低温反应、开花时间、下胚轴伸长和保持昼夜节律，表明 HOS1 作为信号整合因子联系着植物发育与胁迫反应，在调控低温反应、光形态建成和开花时间中发挥至关重要的作用，是很有潜力的作物工程育种目标。拟南芥中，HOS1 编码的蛋白质靠近氨基酸黏性末端为环指结构1，在所有植物组织中都能表达。在正常的生长温度范围内，HOS1 蛋白定位于细胞质，而在低温条件下则在细胞核内积累1。HOS1 是一种 E3 泛素连接酶，为高尔基体膜上的跨膜蛋白，参与蛋白质泛素化降解过程。HOS1 能促进 INDUCE OF CBF EXPESSION 1(ICE1)蛋白的泛素化降解，而失活的 ICE1 降低了 C-EPEATBINDING FACTO(CBF)诱导的很多冷胁迫应答蛋白的活性2-5。此外，生物钟也可以直接或间接地(通过影响 HOS1 活性)调控 CBF3 基因的表达6。HOS1 参与调节拟南芥开花时间。不同光照和温度下，HOS1 通过调节 CONSTANS(CO)蛋白稳定性来调节光周期开花。长日照条件下 HOS1 泛素化降解 CO，当 CO 突变时，hos1 突变体的早花表型受到抑制，进一步支持了光周期开花中 HOS1 介导 CO降解7。此外，PHYTOCHOME B(PHYB)可以介导红光诱导的 CO 蛋白降解来调控开花时间，研究发现 PHYB 可以和 HOS1，CO 产生互作，这3 个蛋白在拟南芥中可能以复合体形式协调光周期反应8。常温下 hos1 突变体呈现早花，因为 HOS1 突变诱导了 FT 基因表达9;拟南芥植株一旦暴露于低温下，HOS1 促进 CO 蛋白迅速降解，且降解作用是独立于PHYB 的10。HOS1 整合了光和温度信号通过调节CO 的丰度调节与温度有关的光周期开花。HOS1也是染色质重塑因子，独立于其 E3 酶活性。在短时间低温条件下，HOS1 影响开花抑制子 FLC 的染色质状态，以调节低温条件下的开花时间11-12。研究发现，HOS1 在调节昼夜节律周期中，可以与 核 膜 上 的 核 孔 复 合 体NUCLEAPOECOMPLEXS(NPCs)相互作用，NPC-HOS1 复合体促进生物钟基因的 mNA 出核13，因此拟南芥 HOS1突变后导致生物钟核心振荡器关键基因的昼夜交替