当归芍药散对制动应激复合半...功能下降模型小鼠的干预作用_张亚萍.pdf

论著基础研究基金项目：广西自然科学基金（）；广西高校中青年教师科研基础能力提升项目（）；广西一流学科建设开放课题（，）；广西中医药大学杰出青年基金项目（）；全国名老中医药专家传承工作室建设项目（）；广西中医药大学“桂派杏林青年英才”项目（）第一作者简介：张亚萍，博士，教授，研究方向：妇科疾病的防治。当归芍药散对制动应激复合半乳糖诱导的卵巢储备功能下降模型小鼠的干预作用张亚萍 蒋姗珊 庞俏燕 王亚静 邵昱玮 游 琛（广西中医药大学基础医学院，广西南宁市；广西中医药大学附属瑞康医院妇科，广西南宁市）【摘要】目的 探讨当归芍药散对制动应激复合半乳糖诱导的卵巢储备功能下降（）模型小鼠的干预作用。方法 选取 只正常动情周期的昆明小鼠，随机挑选 只小鼠为空白组，其余 只小鼠通过制动应激复合注射半乳糖建立 模型。造模结束后将模型小鼠随机分成模型组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组、西药组，各 只。中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组分别给予 （）、（）、（）的当归芍药散灌胃，西药组给予 （）戊酸雌二醇灌胃，空白组、模型组小鼠给予等体积蒸馏水灌胃，连续干预 周。记录干预前后各组小鼠的一般情况。干预结束后，观察各组小鼠卵巢组织的形态学变化，并计算卵巢指数，检测血清卵泡刺激素（）、黄体生成素（）、雌激素、抗米勒氏管激素（）、抑制素 水平。结果 与空白组相比，模型组小鼠动情周期紊乱、卵巢指数下降、闭锁卵泡增多、生长卵泡减少，血清、水平升高，而血清雌激素、抑制素 和 水平降低。与模型组相比，各药物干预组小鼠动情周期恢复正常、闭锁卵泡减少、生长卵泡增多，且中药低剂量组小鼠卵巢指数上升、血清雌激素和抑制素 水平升高，中药中剂量组小鼠血清 水平降低、血清雌激素水平升高，中药高剂量组小鼠血清 水平降低、水平升高，西药组小鼠血清 水平降低（均 ）。结论 当归芍药散可能通过调节 模型小鼠下丘脑垂体卵巢轴功能，来减少闭锁卵泡数目、增加生长卵泡数目，以及降低血清 水平，升高血清雌激素、抑制素 水平，从而改善卵巢储备功能。【关键词】卵巢储备功能下降；当归芍药散；制动应激；半乳糖；卵巢激素；动情周期；模型小鼠【中图分类号】【文献标识码】【文章编号】（）：，（，；，）【】（），（），（），（），（），广西医学 年 月第 卷第 期 ，（），（），（），；，（），【】，随着现代社会生活压力的增大，女性下丘脑垂体卵巢轴对压力的反应更加强烈，这导致生殖功能受到抑制，造成卵巢功能障碍。卵巢储备功能下降（，）是一种由卵巢中卵泡数量减少和 或质量下降引起的较为常见的卵巢功能障碍症状。目前 动物实验模型的构建方法有使用药物（化疗药物、免疫抑制剂、干扰代谢类药物）、射线照射、环境毒物（如去氧乙烯基环己烯）等。半乳糖属于干扰代谢类药物，应用半乳糖造模是一种经典的动物衰老模型构建方法，具有简便、经济、稳定的特点。半乳糖可以直接攻击卵巢，并促进卵巢卵泡储备功能的消耗及 的发生，具有卵巢毒性。研究发现当归芍药散在减轻卵巢损伤、改善卵巢储备功能方面具有一定的治疗效果。但目前其效果及具体作用机制尚未明确。本研究采用制动应激复合半乳糖建立具有肝郁脾虚症状的 小鼠模型，并予以当归芍药散干预，观察当归芍药散对 模型小鼠卵巢激素水平的影响，为当归芍药散用于治疗 提供参考。材料与方法 实验动物 只无特定病原体级昆明雌性小鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司动物合格证号（湘），周龄，体重（），适应性饲养 周，自由饮水和摄食。动物房内室温保持在（），通风良好，保持 光暗循环。主要药物、试剂及仪器 当归芍药散饮片由当归、白芍 、白术 、泽泻 、川芎 、茯苓 组成，当归芍药散饮片共计 ，由广西中医药大学附属瑞康医院提供。小鼠促卵泡激素（，）、黄体生成素（，）、抗米勒氏管激素（，）、抑制素 的 试剂盒均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司（批号：、）；雌激素的 试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司（批号：）；染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司（批号：）；半乳糖购自美国 公司（批号：）；戊酸雌二醇（补佳乐）购自拜耳医药保健有限公司广州分公司（批号：）。小型台式高速冷冻离心机购自 公司；型电子天平购自 公司；型多功能酶标仪购自 公司；型荧光正置显微镜购自 公司。方法 动物造模：（）采用颈背注射半乳糖联合制动应激建立 小鼠模型。先于小鼠颈背部皮下注射 半乳糖（），剂量为 ；然后将小鼠放入前面管壁打孔的 离心管内，盖上离心管的盖子，将小鼠尾巴露出管外，将封闭的离心管放到水平工作台上，后解除制动。次，共干预 周。（）肝郁脾虚型 小鼠模型建模成功的标准。小鼠出现体重下降、毛色萎黄无光泽、活动和饮食减少、大便溏等肝郁脾虚宏观表征，阴道细胞涂片提示动情周期紊乱，卵巢形态上可见生长卵泡减少，而闭锁卵泡相对增多，血清、水平升高，雌激素水平下降。，动物分组和干预方法：以阴道脱落细胞学筛选 只具有连续 个动情周期的小鼠进行实验（动情周期的评判标准见后文“”）。采用随机数字表法挑选 只小鼠作为空白组，其余 只小鼠（造模组）用于建立 小鼠模型。建模结束后，采用随机数字表法将造模组小鼠分成模型组（蒸馏水）、中药高剂量组（高剂量当归芍药散）、中药中剂量组（中剂量当归芍药散）、中药低剂量组（低剂量当归芍药散）、西药组（戊酸雌二醇），各 只。当归芍药散组方的临床用量为 ，参考中药药理研究方法学中人与小鼠体表面积的换算方法，得出小鼠的等效剂量为 （），将该剂量设为中药中剂量组的用药剂量，中药高剂量组、中药低剂量组的用药剂量分别为 （）、（）；用蒸馏水煎煮两次药材并过滤，混合两次所得药液，用旋转蒸发仪分别浓缩出浓度为 、的当归芍药散药液。戊酸雌二醇（补佳乐）临床用量为 ，小鼠等效剂量为 （），将药物研磨成粉末，用蒸馏水配成 药液。各中药剂量组与西药组小鼠均采用灌胃给药，用量按每次 体质量计算（每周称一次体重，体质量取最近一次的称重数值），次，连续干预 后休息 ，共干预 周。空白组、模型组小鼠给予灌胃等体积蒸馏水，干预频次和时间同其余组。取材：在最后一次给药结束后记录各组小鼠体重，后摘除单侧眼球并采血 ，血液装入 管，室温放置，内使用离心机以 离心 ，分离血清，放入 冰箱保存待检。采血后处死小鼠，取出双侧卵巢，使用生理盐水冲洗，吸水纸吸出多余水分后称取双侧卵巢重量，并计算卵巢指数。然后使用组织固定液固定卵巢组织，保存于 冰箱，在 内将卵巢组织包埋，用于后续实验。其中，模型组有 只小鼠因取材不佳，未纳入后续研究。观察指标 一般情况：开始造模的第 天、造模当天和干预开始后每周的最后，记录小鼠的体重，观察其饮食、皮毛、二便、活动等情况。动情周期：小鼠 周龄起，每天早上：，采用阴道脱落细胞学检测小鼠的动情周期，持续观察。使用棉签沾取生理盐水后插入小鼠阴道内旋转 周后取出，于清洁载玻片中央滚动 周。晾干进行 染色，在显微镜下观察阴道上皮脱落细胞情况。小鼠动情周期分为动情前期、动情期、动情后期、动情间期，一般经历 。根据涂片中观察到的各类型细胞相对比例确定样品采集当天小鼠所处的发情周期阶段。在动情前期，细胞几乎为成簇的形状良好的圆形有核上皮细胞；在动情期，细胞主要是角化的鳞状上皮细胞，呈密集的簇状分布；在动情后期，以小的染色深的白细胞为主，可见角化的鳞状上皮细胞，常呈碎片状；在动情间期，白细胞仍占优势，也可能存在角化鳞状上皮细胞，此期与动情后期的主要区别是动情间期有核上皮细胞。见图。图 空白组小鼠阴道脱落细胞学检测结果（染色，）注：为动情前期；为动情期；为动情后期；为动情间期。卵巢镜下结构：将各组包埋的卵巢组织制成 厚的组织切片，放入 的恒温箱中烘干，使用二甲苯脱蜡 ，梯度乙醇水化 ，自来水冲洗 次，染色，中性树胶封片，光学显微镜观察镜下卵巢组织形态学变化。卵巢指数：取出各组小鼠卵巢后，去掉表面的筋膜及脂肪组织，生理盐水清洗，然后使用吸水纸吸取多余的水分，电子秤称量双侧卵巢湿重。卵巢指数按以下公式计算：卵巢指数 双侧卵巢湿重（）小鼠体重（）。血清、雌激素、和抑制素 激素水平：采用 检测各组小鼠血清、雌激素、和抑制素 的水平。将标准品工作液 放入酶标板中，加入待测样本 ，孵育 ；弃液，加入生物素化抗体 ，温育；弃液，加入 洗涤液，浸泡，重复洗涤 次；弃液，加酶结合物工作液 ，避光，温育 左右；弃液，洗涤 次，加 底物溶液，温育 左右，加终止液 。采用酶标仪测 波长处的光密度，根据标准品工作液的浓度和光密度值，使用 软件进行计算。统计学分析 采用 软件进行统计学分析。正态分布的计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用 检验；不符合正态分布的计量资料以（，）表广西医学 年 月第 卷第 期示，组间比较采用非参数检验。以 为差异具有统计学意义。结 果 各组小鼠的一般情况开始造模后，造模组小鼠饮食减少，大便稍溏，皮毛变黄无光泽，喜寐，活动减少，呈烦躁、抵抗状态；随着时间的延长，小鼠开始精神萎靡，抵抗行为减少，动情周期逐渐紊乱（图）。给予药物干预后，模型组与各药物干预组的小鼠体重呈上升的趋势，但除中药中剂量组外，其余组小鼠体重在干预结束时均轻于空白组小鼠。各药物干预组小鼠饮食量增大，大便正常，皮毛变白有光泽，活动量增多，动情周期恢复正常，其中，中药低剂量组和中药中剂量组小鼠的状态恢复较快。见图、图。图 模型组小鼠阴道脱落细胞学检测结果（染色，）注：为动情前期；为动情前期；为动情后期；为动情后期。图 造模后小鼠体重变化情况图 药物干预后各组小鼠体重变化情况 药物干预后各组小鼠卵巢形态结构的变化情况 与空白组相比，模型组小鼠的卵巢体积减小，生长卵泡数目、成熟卵泡数目减少，闭锁卵泡数目增多，黄体体积缩小，卵巢实质破坏，出现纤维化和较大的间质孔；给予药物干预后，与模型组相比，各药物干预组小鼠生长卵泡数目增多，闭锁卵泡数目减少，卵巢实质结构有所改善，纤维化现象和较大的间质孔数目减少，其中中药中剂量组的改善较为明显。见图。图 各组小鼠卵巢组织形态改变（染色，）注：为空白组；为模型组；为中药低剂量组；为中药中剂量组；为中药高剂量组；为西药组。各组小鼠卵巢指数的比较与空白组相比，模型组、中药高剂量组和西药组小鼠的卵巢指数均降低（均 ）；与模型组和西药组相比，中药低剂量组小鼠的卵巢指数均升高（均 ）。见表。表 各组小鼠卵巢指数的比较（，）组别卵巢指数空白组 模型组 中药低剂量组 中药中剂量组 中药高剂量组 西药组 值 值 注：与空白组比较，；与模型组比较，；与中药低剂量组比较，。各组小鼠激素水平的比较与空白组相比，模型组小鼠血清、水平升高，血清雌激素、抑制素、水平下降（均 ）。与模型组相比，中药低剂量组小鼠血清雌激素、抑制素 水平升高（均 ）；中药中剂量组小鼠血清 水平下降，血清雌激素水平升高（均 ）；中药高剂量组小鼠血清 水平下降，血清 水平升高（均 ）；西药组小鼠血清 下降（）。见表。，表 各组小鼠激素水平的比较组别（，）（，），雌激素（，），（，），抑制素（，），空白组 （，）（，）（，）（，）模型组 （，）（，）（，）（，）中药低剂量组 （，）（，）（，）（，）中药中剂量组 （，）（，）（，）（，）中药高剂量组 （，）（，）（，）（，）西药组 （，）（，）（，）（，）值 值 注：与空白组比较，；与模型组比较，。讨 论 半乳糖血症是一种遗传性的代谢疾病，会影响机体的半乳糖代谢能力，与卵巢储备功能密切相关。半乳糖代谢在 途径中主要涉及 种酶，包括半乳糖激酶、半乳糖 磷酸尿嘧啶转移酶和 半乳糖 环氧酶。半乳糖 磷酸尿嘧啶转移酶的严重缺乏会导致半乳糖及其代谢产物积聚，引发半乳糖血症，对机体产生毒性作用，长期并发症包括女性的轻度发育迟缓、智力缺陷、语言发育障碍、骨密度降低和运动障碍。此外，半乳糖及其代谢产物在卵巢中可直接攻击卵母细胞和卵泡，导致卵巢池闭锁加速和卵泡成熟受阻，引起卵巢功能障碍、月经周期紊乱和生育能力下降。制动应激是研究慢性压力相关疾病常用的模型之一，可引起卵巢功能的紊乱和减退。连晓媛等应用重复制动应激刺激大鼠，使大鼠出现性月经周期紊乱、