大豆磷转运蛋白GmPHO1...7基因克隆、表达分析与功能_刘丽薇.pdf

http:/Email:jlndxb 吉林农业大学学报 2023，45（1）：14-21Journal of Jilin Agricultural University大豆磷转运蛋白GmPHO1;7基因克隆、表达分析与功能*刘丽薇，付禹，于人杰，何旭，杨雪，杨美英*吉林农业大学生命科学学院，长春 130118摘 要：以“长农26”为材料，克隆获得全长为2 295 bp的核苷酸序列，编码765个氨基酸，命名为GmPHO1；7。生物信息学分析表明，GmPHO1；7的氨基酸序列具有完整的SPX与EXS结构域，该基因启动子区含有低磷相关元件P1BS，可能定位是在细胞膜上的跨膜蛋白，属于磷转运蛋白PHO1家族。酵母功能互补试验证明GmPHO1；7 具有转运磷的能力。基因表达分析发现，在正常磷（0.5 mmol/L KH2PO4）和低磷（0.01 mmol/L KH2PO4）条件下，GmPHO1；7的表达受低磷诱导并且主要在根部发挥功能。GUS染色与含磷量测定结果证明，GmPHO1；7基因可以在大豆发根中正确表达，且可以增加发状根的含磷量。关键词：大豆；磷转运蛋白；GmPHO1；7基因；发状根中图分类号：S565.1 文献标志码：A 文章编号：1000-5684（2023）01-0014-08DOI：10.13327/j.jjlau.2021.1067引用格式：刘丽薇，付禹，于人杰，等.大豆磷转运蛋白GmPHO1；7基因克隆、表达分析与功能 J.吉林农业大学学报，2023，45（1）：14-21.Cloning,Expression Analysis and Function of Soybean Phosphorus Transporter GmPHO1;7 Gene*LIU Liwei，FU Yu，YU Renjie，HE Xu，YANG Xue，YANG Meiying*College of Life Sciences，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，ChinaAbstract：Using Changnong 26 as the material,this study cloned a 2 295 bp nucleotide sequence encoding 765 amino acids,named GmPHO1;7.Bioinformatics analysis showed that the amino acid sequence of GmPHO1;7 has complete SPX and EXS domains.The promoter region of this gene contains the low-phosphorus-related element P1BS,which may be a transmembrane protein located on the cell membrane and belongs to the PHO1 family of phosphorus transporters.Yeast complementation experiments proved that GmPHO1;7 has the ability to transport phosphorus.Gene expression analysis under normal phosphorus(0.5 mmol/L KH2PO4)and low phosphorus(0.01 mmol/L KH2PO4)conditions revealed that the expression of GmPHO1;7 is induced by low phosphorus and functions mainly in the roots.GUS staining and determination of phosphorus content proved that GmPHO1;7 gene can be correctly expressed in soybean hairy roots and can increase the phosphorus content of hairy roots.Key words：Glycine max；phosphorus transporter；GmPHO1；7 gene；hair root磷是土壤有机质的重要元素，土壤中总磷含量较高。但由于其在土壤中的低溶解度和高吸附能力，植物可直接利用的有效磷仅有0.11 mg/kg1。现已发现，植物通过磷转运蛋白家族：PHT1*基金项目：吉林省自然科学基金项目（20170101160）作者简介：刘丽薇，女，在读硕士，研究方向：生物化学与分子生物学。收稿日期：2021-01-29*通信作者：杨美英，E-mail：刘丽薇，等：大豆磷转运蛋白GmPHO1；7基因克隆、表达分析与功能吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural UniversityPHT5和 PHO1，从土壤中获取磷，并将磷转运和再分配到其他部位2。PHT1家族负责从土壤中摄取磷到植物中3。PHT2家族通过介导叶绿体对磷的摄入影响植物光合作用4-5。PHT3家族负责线粒体中的磷转运6-9，PHT4家族负责细胞质与类囊体、高尔基体间磷的平衡10-14。PHT5家族维持着细胞整体磷浓度的稳定15-16。PHO1 广泛存在于陆地植物、真菌和动物中17，该家族具有磷转运的能力18。对水稻、拟南芥PHO1家族的研究发现，PHO1家族参与植物中磷从根向叶运输的过程。水稻OsPHO1；2突变体在低磷条件下，根系获得磷的比例下降，从根到茎的磷转移水平下降19。拟南芥AtPHO1；H1受低磷的诱导上调表达，恢复正常磷水平8 h后会恢复到正常表达水平20，AtPHO1；H1启动子在根和茎中的维管组织中表达，并参与了从根到茎尖的远距离转运21。因此，PHO1及其同源物在植物磷代谢过程中，发挥着重要作用，对植物的正常生命活动具有重要意义。He等18对大豆PHO1家族的系统发育、结构进化和功能多样性进行了详细研究，结果表明，大豆GmPHO1家族有14个成员，分别在不同的器官中发挥功能。目前对于大豆PHO1家族单一成员系统研究的报道还比较鲜见。本研究克隆了大豆GmPHO1；7基因，利用酵母功能互补及大豆发根转化等试验探究其功能，为详细解析大豆PHO1家族成员在生物体内的作用提供数据支撑。1材料与方法1.1供试材料大豆（Glycine max）品种“长农26”，发根农杆菌K599，质粒pCAMBIA3301，质粒pYES2，啤酒酵母 突 变 株 品 种 PAM2（pho89：TRP1，pho84：HIS3 ade2 leu2 his3 trp1 ura3）均为吉林农业大学作物营养与调控实验室保存。1.2盆栽试验选取颗粒饱满的大豆种子，进行沙培，育苗采用上口径11.5 cm、下口径7.5 cm、高9.5 cm的育苗盆。每盆装 1 kg 23 mm 口径细沙，每盆定苗3株，共培育 30盆，种植于吉林农业大学理工楼人工气候室。浇灌Hogland营养液 22，以KH2PO4（0.5 mmol/L）为唯一磷源。生长条件：光照08：0021：00，（251）；黑暗21：0008：00，（221）；光照强度2万 lx；湿度60%。待大豆生长至3叶期，分别进行0.5 mmol/L KH2PO4和0.01 mmol/L KH2PO4的Hogland营养液培养，作为对照和低磷处理。在大豆的苗期、分枝期、花期、结荚鼓粒期、成熟期进行取样，取样部位为主根、茎尖与顶端第1叶片。1.3植物RNA的提取采用Trizol法提取植物RNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，并用NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白浓度测定仪测定RNA浓度，使用Takara PrimeScript RT reagent Kit（Perfect Real Time）反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，用于后续试验。1.4GmPHO1;7基因的克隆在数据库 Phytozomo V12.1 中获得大豆 GmPHO1；7 基 因 序 列（Glyma.10G004800），利 用Primer 5.0 设 计 特 异 引 物（GmPHO1；7-F：TTCTCCCTTCACAACACAAA，GmPHO1；7-R：ATTGCCTATCCCTTTTACAG）进行扩增。PCR 扩增程序：95 5 min，95 30 s，55 30 s，72 145 s，循环数30；72 10 min。回收PCR产物与pMD-18T连接，转入DH5，鉴定为阳性的克隆送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序。1.5生物信息学分析利用在线网站对 GmPHO1；7 基因及蛋白进行预测分析，具体网站功能和网址见表1。1.6荧光定量分析利用软件 Prime5.0 设计荧光定量引物（Q-GmPHO1；7F：AATCACAAGCCCCAGAAGAGTC，Q-GmPHO1；7R：ACCTCTTCACTCTCCTCCGTTG）。表1在线分析网站及网址Table 1Website for online analysis and website link网站ProtParaTMHMMPLANT eFPInterProTargetP网站功能理化性质分析跨膜区分析基因芯片表达量预测蛋白质结构域预测亚细胞定位预测网址链接https:/web.expasy.org/protparam/http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/http:/bar.utoronto.ca/eplant_soybean/http:/www.ebi.ac.uk/interpro/scan.htmlhttp:/www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/15吉林农业大学学报 2023 年 2 月Journal of Jilin Agricultural University 2023，February按照SYBR Green Realtime PCR Master Mix（Rox）说明书配制反应体系。反应程序：95 10 min；95 15 s，55 30 s，72 20 s，40个循环；95 30 s，60 1 min，95 15 s。用2-CT算法计算相对表达量。1.7酵母异源功能互补试验设计带有限制性内切酶酶切位点 Kpn 和Sph 的 PCR 引 物（pYES2-GmPHO1；7-F：GG GGTACCATGGTGAAATTCTCGAAGGA，pYES 2-GmPHO1；7-R：CATGCATGCTCAGCTGTCTGAGT CTATGTCAC）。将 GmPHO1；7 克隆到酵母表达质粒pYES2中构建pYES2-GmPHO1；7表达载体。将表达载体和空载体（作为对照）分别转化到啤酒酵母突变株 PAM2（pho89：TRP1，pho84：HIS3 ade2 leu2 his3 trp1 ura3）中。PAM2 酵母缺少高亲和磷酸盐转运蛋白PHO84和PHO89，低磷情况下缺少从外界转运磷的能力，且不能合成Ade2和Ura3 这 2种氨基酸。转化的酵母菌株利用 YNB培养基，30，生长至对数期，然后用无磷的YNB培养基（包含等浓度的氯化钾而不是磷酸钾）收集并洗涤（在1 500 g，4，离心5 min）。将收集的沉淀物悬浮在相同的培养基中，30 培养，直到OD600 达到1.0。转化的PAM2酵母在YNB固体培养基上的生长条件：通过血细胞计数板方法分别计算出102、103、104个酵母细胞，并接种在pH 6.0 低磷（20 mmol/L）YNB 琼脂平板上，30 下培养3 d23，拍照并记录结果。1.8发根农杆菌诱导大豆发状根设计带有限制性酶切位点 BamH 和 Pst 的