大黄酒蒸前后对正常小鼠血清炎症因子及肠道菌群的影响_张桥.pdf

年 月第 卷第 期陕 西 中 医 药 大 学 学 报 大黄酒蒸前后对正常小鼠血清炎症因子及肠道菌群的影响张桥 赵重博 宋艺君 张丽 颜永刚 乐世俊 唐于平（陕西中医药大学陕西省中药饮片工程技术中心，陕西 咸阳；南京中医药大学翰林学院，江苏 泰州；陕西中医药大学 陕西省秦岭中草药应用开发工程技术研究中心，陕西 咸阳；陕西中医药大学 陕西省中医药管理局中药配伍重点研究室，陕西 咸阳）摘 要：目的 比较大黄酒蒸前后对正常小鼠血清炎症因子及肠道菌群的作用差异，进而探讨酒蒸缓和大黄副作用（腹泻）的潜在作用机制。方法 只雄性 小鼠随机分为空白组、生大黄及熟大黄高、中、低（、）剂量组，空白组给予等体积的 生理盐水，生大黄及熟大黄各组给予相应水煎液，连续灌胃 （次），分别在第 、观察小鼠精神状态，收集粪便测定粪便含水量并进行 测序，采用酶联免疫吸附测定法（）检测血清中肿瘤坏死因子（）、干扰素（）、白细胞介素（）水平，采用苏木精伊红（）染色进行小鼠小肠组织病理学观察。结果 与空白组比较，生大黄高、中剂量组及熟大黄高剂量组粪便含水率均显著升高，熟大黄升高程度小于生大黄。与空白组比较，生、熟大黄对小鼠小肠具有不同程度的损伤，随着给药时间的延长，生大黄高剂量组损伤加剧，而熟大黄各组变化不明显。与空白组比较，生、熟大黄均可升高血清中、含量，且熟大黄各组含量的升高程度小于生大黄组。与空白组比较，生、熟大黄组肠道菌群分类单元（）总数及 多样性降低，而熟大黄组降低程度略小于生大黄组。与空白组比较，生、熟大黄均可升高链球菌属（）、志贺氏菌属（）丰度，然熟大黄对其影响程度小于生大黄，此外，生大黄可降低乳杆菌属（）丰度，而熟大黄对其影响没有显著性。结论 生大黄引起腹泻的原因可能主要是由肠道菌群的失调以及炎症因子水平异常所导致，熟大黄能够在一定程度上缓解肠道菌群的失调，抑制炎症因子的表达，进而缓解生大黄所致腹泻的副作用。关键词：大黄；酒蒸；小鼠；炎症因子；肠道菌群中图分类号：文献标识码：文章编号：（）：（，；，；，；，）基金项目：国家自然科学基金项目（，）；陕西省自然科学基金青年项目（）；陕西省中医药管理局科研项目（）；陕西省教育厅科研项目（）；陕西中医药大学学科创新团队项目（）通讯作者：唐于平，教授。：陕 西 中 医 药 大 学 学 报 年 月第 卷第 期 ：，（），（，），（），（），（），（）（）（），（），：；中药用于预防和治疗疾病已有上千年历史，在发挥其疗效的同时，部分中药也表现出一定的不良反应，且得到了越来越多的关注。年全国药品不良反应报告中，涉及怀疑药品 万次，其中中药占 ，表明中药的潜在毒 副作用不容忽视。大黄为蓼科植物掌叶大黄 、唐古特大黄 、或药用大黄 的干燥根及根茎，味苦，性寒，始载于神农本草经，具泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄的功效。大黄作为我国大宗药材之一，然长期使用常导致一系列胃肠不良反应，主要包括腹泻、腹痛、呕吐等症状，进而严重制约着大黄的临床应用。此外，大黄“寒性”过偏，泻下作用峻烈，表现出腹泻、腹痛的副作用。章从恩研究结果表明生大黄剂量达到 时，其对胆汁淤积性肝炎模型大鼠的疗效最佳，同时从粪便含水率分析其在发挥药效时伴有一定程度的腹泻。大黄炮制品最早记录于汉代张仲景的金匮玉函经中，曰“皆去黑皮、或炮或生，清酒洗，酒浸。”酒为医用最早记载于五十二病方，以“卒、沃、煮、渍”等多种炮制方法体现。年版中国药典记载熟大黄制法为取净大黄块，照酒蒸或酒炖（通则）蒸或炖至内外均黑色，且酒制的饮片无特殊规定则使用黄酒，酒蒸可制约大黄“寒性”，缓解腹痛、腹泻的副作用。文献研究表明，与熟大黄组相比，生大黄组的小鼠发生腹泻状况较严重，粪便呈溏稀状，而熟大黄组粪便呈软状。亦有研究表明在治疗慢性肾衰竭脾肾气阴两虚湿浊症患者时，给予含有熟大黄的复方后出现腹泻、腹痛现象（）明显低于含有 年 月第 卷第 期陕 西 中 医 药 大 学 学 报 生大黄的复方（），且短期疗效优于生大黄复方组。尽管研究报道酒蒸可纠正大黄“寒性”过偏，缓和药性、减轻腹痛等胃肠反应，但现有文献仍未阐明酒蒸缓和大黄腹泻、腹痛的作用机制。肠道菌群在维持宿主体内稳态和健康方面发挥着重要作用，在正常生理情况下，肠道菌群（有益菌、致病菌）结构及组成处于稳态平衡，具有强大的生理功能，与宿主之间相互作用，发挥代谢、免疫、维持肠道屏障稳态等功能；在病理状态下，肠道的微生态系统受到严重破坏，大肠杆菌、梭杆菌等条件致病菌数量增多，而双歧杆菌、乳杆菌等益生菌数量下降。课题组前期通过文献综述发现，腹泻的发生、发展常伴随着肠道菌群的失调即有益菌丰度的降低及致病菌丰度的升高，此外包括肠道免疫功能低下及促炎症因子的释放。基于此，本实验采用 及酶联免疫吸附测定法（）手段，比较大黄酒蒸前后对正常小鼠血清炎症因子及肠道菌群的作用差异，为阐释酒蒸缓和大黄腹泻、腹痛副作用的作用机制提供实验依据。材料 试药 大黄药材购于甘肃省甘南州，经陕西中医药大学颜永刚教授鉴定，为唐古特大黄 的干燥根及根茎，氯化钠为分析纯（国药集团化学试剂有限公司，批号：），肿瘤坏死因子（）、干扰素（）、白细胞介素（）试剂盒均购自江苏省南 京 建 成 生 物 工 程 研 究 所，批 号 分 别 为、。中性多聚甲醛（国药集团化学试剂有限公司，批号：）。黄酒（绍兴柯桥第三酒厂，批号：）。仪器 型电子分析天平（北京欧信胜科技有限公司，精确到 ），型打粉机（天津泰斯特公司），型 光 吸 收 酶 标 仪（公司，美国），高通量测序仪（美国 公司），型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司），型显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司），冰箱（美国 公司），型低温离心机（德国 公司）。自制超纯水（，）。实验动物 健康的 小鼠，级，体质量（），购自成都达硕实验动物有限公司。动物许可证号：（川）。动物实验获得陕西中医药大学动物伦理委员会批准（伦理授权号：）。方法 生、熟大黄水煎液的制备按照课题组前期方法，制备生、熟大黄饮片。生大黄：除去杂质，洗净，润透，切厚片，晾干。熟大黄：取生大黄片，用黄酒拌匀（），闷润至透，置蒸制容器内，蒸至内外均成黑色，取出放凉，干燥后备用。大黄临床使用以入煎剂主，热水短时间煎煮即可。取生、熟大黄饮片，打粉过 号筛。以 倍量水浸泡 后加热煮沸 ，过滤后，药渣再用 倍水煎煮两次，各 ，合并 次滤液，减压浓缩至 。贮存于 冰箱备用。动物分组及给药 将 只 小鼠置于清洁级动物室中，适应一周饲养后，随机分为 组，即空白组（，）、生大黄高、中、低剂量组（、）和熟大黄高、中、低剂量组（、），生、熟大黄组按人临床日用量（）的等倍、四倍、八倍进行给药，空白组给与等体积生理盐水，连续给药 ，在第 、给药 后，收集粪便于冻存管中，保存，用于 测序。采用摘眼球取血，用于检测血清中炎症因子表达水平，然后取小肠组织于 中性多聚甲醛溶液中保存，进行 染色，观察组织病理学变化。各组小鼠一般情况观察及粪便含水量测定给药期间观察小鼠的精神状态、行为活动、饮食状况、体重变化，肛门干净程度及粪便形态。收集小鼠新鲜粪便，以干湿粪便质量差计算粪便含水率，含水率 （粪便湿重量 粪便干重量）粪便湿重量。小鼠小肠组织病理形态学观察 取各组小鼠小肠组织适量，放入含有 中性多聚甲醛溶液的 离心管固定，染色，操作方法同前期研究一致，显微镜下观察其组织形态学变化。小鼠血清炎症因子检测分别在第 、陕 西 中 医 药 大 学 学 报 年 月第 卷第 期 给药结束后，每组各取 只，摘眼球取血，静置 后 离心，取上清液，存储于 ，备用。按各试剂盒对应方法测定各样品中、水平。基因测序参照试剂盒 进行小鼠粪便中总 的提取，存于 冰箱。利用 分光光度计和琼脂糖凝胶电泳分别测量所提取 的数量和质量，用正向引物（）反向引物（）对 区进行聚合酶链式反应（）扩增，然后用 进行 产物纯化，用 进行定量，采用 平台进行测序，最后在派森诺基因云（：）上进行数据分析。统计学方法采用 软件进行分析，采用 软件作图，数据用 表示，组间比较采用 （）。和 表示差异具统计学意义。结果 小鼠一般情况观察给药后观察小鼠精神状态、行为活动、粪便形态等情况变化。实验期间无死亡状况发生，空白组小鼠精神状态良好，毛发光亮，二便正常。给药组小鼠精神萎靡，蜷缩，肛周污秽，有稀便出现。如图 及 所示，第 及第 各给药组与空白组相比，高、中剂量组及 高剂量组粪便含水率均显著升高，其余各组没有显著性差异；如图 所示，与第 各给药组相比，第 各给药组中，高、中剂量组粪便含水率均显著升高。第 各给药组与空白组组相比，；第 各给药组与空白组组相比，；生、熟大黄各剂量组相比，；第 与第 相应两组相比，图 各给药组对粪便含水率的影响（）生、熟大黄对小鼠小肠组织形态学的影响如图 所示，空白组小鼠肠粘膜结构未受损，腺体排列正常，无水肿及炎性细胞浸润情况发生。与空白组比较，第 的 组小鼠肠粘膜固有层可见大量中性粒细胞和上皮脱落严重，绒毛之间的间隙扩大，病理变化次之，组较弱；与 各组比较，各组症状有所减轻。与第 各组结果比较，第 的 组症状有所加重，及 组病理变化不明显；各组症状变化亦不明显。生、熟大黄对小鼠血清中、的影响 如图 所示，第 各给药组与空白组相比，高、中剂量组和 高剂量组血清中、的含量均显著升高，中剂量组对 含量的影响亦显著升高；与 各剂量组相比，除 高剂量组对 含量影响显著降低外，其余 各剂量组对、的影响均未有显著性差异。如图 所示，第 各给药组与空白组相比，高、中剂量组和 高剂量组血清中、的含量均显著升高，中剂量组对 含量的影响亦显著升高。与 各剂量组相比，高剂量组对、含量影响显著降低，中剂量组对 含量的影响亦显著降低，其余 各剂量组对、的影响均未有显著性差异。该结果表明，生、熟大黄均能引起小鼠血清中炎症因子含量的升高，而熟大黄的作用较弱。年 月第 卷第 期陕 西 中 医 药 大 学 学 报 图 小肠 染色结果（，：第 ；：第 ）第 各给药组与空白组组相比，；第 各给药组与空白组组相比，.；生、熟大黄各剂量组相比，；第 与第 相应两组相比，.图 各给药组对血清，及 的影响（）陕 西 中 医 药 大 学 学 报 年 月第 卷第 期 如图 所示，与第 各给药组相比，第 各给药组中，除 中剂量对 含量影响外，高、中剂量组和 高、中剂量组血清中、的含量均显著升高，此外，低剂量组对 含量的影响亦显著升高。该结果表明，给药时间的延长，可加剧小鼠血清中的炎症反应发生。生、熟大黄高剂量对正常小鼠肠道菌群的影响 肠道菌群整体变化及稀释曲线分析 依据测序结果，在基因云上进行分析，根据不同分组进行 图绘制。如图 所示，（第 空白组）有 个，（第 生大黄高剂量组）组有 个，（第 熟大黄高剂量组）组有 个，（第 空白组）有 个，组（第 生大黄高剂量组）有 个，（第 熟大黄高剂量组）组有 个，各组间相同 共 个。该结果说明各组间菌群结构差异较大，即给药后菌群的 总数下降，组下降幅度大于 组，且随时间的延长，下降幅度有所提高。如图 所示，各组的稀释曲线趋于平缓，表明本次测序数据量足够，可基本反映样本中绝大多数的微生物多样性信息。图 图（）和稀疏曲线（）多样性分析 多样性指某个群落或生境内部的物种的多样性，多指均匀环境下的物种数目，即用来度量群落内的物种多样性。如图 所示，及 分析结果表明，与空白组相比，各给药组菌群丰富度、多样性均有显著性差异；分析结果表明，与空白组相比，及 菌群丰富度、多样性没有显著性差异，但 菌群丰富度、多样性具有显著性差异。多样性分析 在 多样性分析中，通过 分析来对比各组样本之间的差异。如图 所示，第 及 的空白组、生大黄组及熟大黄组组内样品距离较小，能大致聚在一起，表明菌群结构分布紧凑、相似度高；生、熟大黄给药组肠道菌组成与空白组均有明显差异；随着给药时间的延长，熟大黄组有向空白组转向的趋势。物种组成分析 如图 所示，在门水平上，各组 厚 壁 菌 门（）、拟 杆 菌 门（）和变形菌门（）是最主要的物种，其相对丰度达 以上，其次还有放线菌门（）及疣