大豆GmWRKY52生物信...GmNF-YA13互作研究_刘灿.pdf

大 豆 科 学 Soybean Sciencehttp:/ddkx haasep cn2023，42(2):175-181DOI:10 11861/j issn 1000-9841 2023 02 0175大豆 GmWKY52 生物信息学分析及与 GmNF-YA13 互作研究刘灿1，聂天明2，于月华2，倪志勇1(1 新疆农业大学 生命科学学院，新疆 乌鲁木齐 830052;2 新疆农业大学 农学院，新疆 乌鲁木齐 830052)摘要:WKY 转录因子在植物生长发育及逆境调控过程发挥着重要作用。前期通过酵母双杂交筛选干旱处理后的大豆 cDNA 文库时发现 GmWKY52(NP_001237726 2)可能与 GmNF-YA13 蛋白存在互作，为明确二者是否存在互作，本研究克隆 GmWKY52 基因并进行生物信息学分析，利用酵母双杂交系统鉴定 GmWKY52 和 GmNF-YA13 之间的互作关系。结果显示:GmWKY52 基因全长 1 163 bp，编码 1 个由 265 个氨基酸组成的蛋白质，多序列比对和系统发育树分析结果说明 GmWKY52 基因与野生大豆 GsWKY69(XP_028186817 1)亲缘关系较近。酵母双杂交结果表明 GmWKY52 和 GmNF-YA13 蛋白不存在相互作用。研究结果说明 GmWKY52 与 GmNF-YA13 蛋白在酵母细胞内并不发生互作。关键词:大豆;GmWKY52;生物信息学分析;酵母双杂交;GmNF-YA13收稿日期:2022-09-19基金项目:国家自然科学基金(32160446);新疆农业大学研究生创新项目(XJAUGI2022041)。第一作者:刘灿(1998)，男，硕士研究生，主要从事植物逆境分子生物学研究。E-mail:liuc1998 qq com。通讯作者:倪志勇(1981)，男，博士，教授，主要从事植物逆境分子生物学研究。E-mail:nizhiyong126 com;于月华(1981)，女，博士，高级实验师，主要从事作物抗逆分子育种研究。E-mail:yuyuehua1213 sina com。Bioinformatics Analysis of Soybean GmWKY52 and Studies of Interaction withGmNF-YA13LIU Can1，NIE Tian-ming2，YU Yue-hua2，NI Zhi-yong1(1 College of Life Sciences，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China;2 College of Agriculture，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China)Abstract:WKY transcription factor plays an important role in the regulation of plant growth and stress response A WKYprotein GmWKY52(NP_001237726 2)，which may interact with GmNF-YA13，was found by screening the soybean cDNAlibrary after drought treatment by yeast two-hybrid For identifying any potential interactions between the two，this studycloned GmWKY52 and carried out bioinformatics analysis，identified the interaction between GmWKY52 and GmNF-YA13by yeast two-hybrid The results showed that the GmWKY52 gene was 1 163 bp in full length and encoded a protein composedof 265 amino acids And the multi-sequence alignment and phylogenetic tree analysis showed that GmWKY52 was closelyrelated to wild soybean GsWKY69(XP _028186817 1)Yeast two-hybrid results showed no interaction between theGmWKY52 and GmNF-YA13 proteins The results show that GmWKY52 and the GmNF-YA13 protein do not interactwithin yeast cellsKeywords:soybean;GmWKY52;bioinformatics analysis;yeast two-hybrid;GmNF-YA13WKY 转录因子家族是植物中最大的转录因子家族之一，因含有保守的 WKY 结构域而得名，广泛分布于多种植物中。WKY 结构域包含 60 个氨基 酸，其 中 N-端 包 含 保 守 的 氨 基 酸 序 列WKYGQK，C-端包含 C2H2(CX4-5CX22-23HX1H)型或 C2HC(CX7CX23HXC)型锌指基序1。1994 年Ishiguro 等2 从甘薯(Ipomoea batatas)中分离获得了第一 个 植 物 WKY 家 族 基 因 SWEET POTATOFACTOS1(SPF1)。随着测序技术的发展，近年来许多物种中的 WKY 家族成员接连被发现和鉴定，其中拟南芥(Arabidopsis thaliana)中 74 个3、水稻(Oryza sative)中 109 个4、玉米(Zea mays)中 119个5、番茄(Solanum lycopersicum)中 81 个6、谷子(Setaria italic)中 105 个7、大豆(Glycine max)中176 个8、油菜(Brassica napus)中 343 个9、小麦(Triticum aestivum)中 171 个10 和甘蔗(Saccharumspontaneum)中 154 个11。WKY 转录因子可以结合 W-box(T)(T)TGAC(C/T)元件以调节下游基因表达，也可以作为转录活化子特异性地结合糖反应元件 SUE12。已知 WKY 转录因子参与植物生长发育的各个过程，包括促进细胞及细胞器构成13、调控植株矮化14-15、诱导植物开花16、调控植物果实成熟17-18、调控植物休眠与衰老19-20 等。同时，WKY 家族成员在植物响应逆境胁迫的过程中起着关键作用，既参与对病原菌和植食性昆虫的防御反应，也参与对干旱、盐碱、高温、低温、营养缺失等非生物逆境胁迫的应答21。可见，WKY 转录因子在植物应对逆境胁迫中的作用不可忽视。176大 豆 科 学2 期虽然关于 WKY 蛋白的功能已经有了大量的研究成果，但仍存在一些薄弱之处:第一，目前对WKY 转录因子参与非生物胁迫响应的研究主要集中在干旱、高盐、低温等胁迫，关于 WKY 转录因子参与响应高温胁迫的研究相对较少;第二，大部分 WKY 转录因子的研究尚处于基因克隆、功能鉴定和表达分析等层面上，在植物逆境应答作用机理方面的研究相对较少;第三，对 WKY 转录因子的研究主要集中于水稻和拟南芥等模式作物，在其他植物中的研究还不够深入。因此本研究一方面为植物抗逆基因工程提供新的基因源，另一方面希望从转录因子互作蛋白鉴定的方面为探索大豆 WKY 转录因子发挥功能的分子机制提供一定基础。大豆是重要的粮食和经济作物，但由于我国的大豆产量远低于需求，进口大豆长期占据中国粮食进口的主导地位。放眼全球，中国的大豆进口量约占大豆贸易的 60%22。各种生物与非生物胁迫影响是造成大豆产量与品质严重受损的主要原因之一，据报道，非生物胁迫会对农作物造成 6%20%的损失23-24。研究显示，大豆中有多个 WKY 转录因子参与调控生物胁迫与非生物胁迫的应答。Yu等25 发现，在大豆根系中有 65 个 WKY 基因在盐胁迫 后 表 达 上 调，只 有 1 个 WKY 基 因GmWKY71 表达下调;在整个大豆植株中，这 66 个基因在盐胁迫下表现出不同的表达模式，其中 12 个表达量没有明显变化，35 个表达下降，19 个被诱导。Shi 等26 发 现，在 正 常 生 长 的 大 豆 组 织 中，GmWKY12 基因的表达量较低，但在盐和干旱胁迫条件下表达量升高，进一步研究发现在大豆毛状根中 GmWKY12 的过表达增强了耐旱性和耐盐性，说明 GmWKY12 对干旱与盐胁迫具有正调控作用。这些结果为今后研究大豆 WKY 基因在逆境条件下的作用机理提供了重要线索。实验室发现大豆中的 NF-YA 基因 GmNFYA13受到盐、干旱、ABA 和过氧化氢的强烈诱导，报道显示，过表达 GmNFYA13 增强了大豆植株的耐盐性和耐旱性27，以大豆 GmNF-YA13 蛋白为诱饵蛋白，通过酵母双杂交筛选干旱处理后的大豆 cDNA 文库，筛选出一个 WKY 蛋白 GmWKY52。本研究克隆大豆 GmWKY52 基因，利用生物信息学方法分析该蛋白的理化性质、蛋白结构及其与其他物种 WKY蛋白间的亲缘关系，并通过酵母双杂交系统进一步验证 GmWKY52 与 GmNF-YA13 蛋白之间是否存在互作关系。以期为今后大豆 WKY 蛋白作用机理的深入研究奠定了基础。1材料与方法1 1材料供试大豆品种为 Williams 82。普通 DNA 产物纯化回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购于天根生物公司。高保真酶购自全式金生物公司，T4DNA 连接酶和限制性内切酶(Eco I，Xho I)购自 Thermofisher 生物公司。引物合成与DNA 测序服务由生工生物公司(上海)完成。AH109 酵母菌株、pGBKT7、pGADT7 酵母表达载体及 pGBKT7-NFYA13 诱饵载体为本实验室保存;各种酵母培养基均购自泛基诺公司。1 2方法1 2 1大豆总 NA 提取与反转录采用 Trizol法28 提取大豆叶片总 NA，使用赛默飞世尔超微量核酸蛋白浓度测定仪 NanoDrop ONCE 分析总NA 浓度和纯度，进一步采用 1%琼脂糖凝胶电泳检测总 NA 质量，选择满足后续实验需求的 NA。按照天根生物公司反转录试剂盒说明书的具体操作步骤将提取的 NA 反转录合成 cDNA 第一链，将所得产物存于 20 冰箱以备用。1 2 2WKY52 基因克隆根据 NCBI 数据库(https:/www ncbi nlm nih gov/)的 GmWKY52(登录号:NM_001250797 2)序列，使用 Primer 5 0软 件 设 计 特 异 性 引 物:WKY52-AD-F(5-CCGGAATTCATGCATCACCGTAGATTCAGC-3，下划线表 示 Eco I 识 别 位 点);WKY52-AD-(5-CCGCTCGAGTTATCCTGTGATGCCGCC-3，下划线表示 Xho I 识别位点)。以大豆叶片 cDNA 为模板进行 PC 扩增，反应体系为 10 Buffer(含 Mg2+)2 5 L、2 5 mmol L-1dNTPs 2 0 L、上下游引物各2 0 L、cDNA 模板 1 0 L、Taq 酶 0 5 L、最后加入超纯水至总体积为 25 L。PC 反应条件为:98 5 min;98 30 s，60 30 s，72 1 min，循环 35 次;72 10 min。使用天根公司的产物纯化回收试剂盒纯化回收 PC 扩增产物，送至生工生物公司(上海)进行测序。1 2 3