多光谱法、分子对接模拟和生...素与小窝蛋白-1的相互作用_侯倩宜.pdf

第 卷，第期 光谱学与光谱分析 ，年月 ，多光谱法、分子对接模拟和生物膜干涉研究槲皮素与小窝蛋白的相互作用侯倩宜，董壮壮，原红霞，李青山，山西中医药大学中药与食品工程学院，山西 晋中 山西中医药大学，基于炎性反应的重大疾病创新药物山西省重点实验室，山西 晋中 摘要小窝蛋白（）在动脉粥样硬化等心血管疾病的发生发展中发挥关键作用。为了解槲皮素与 的相互作用，在模拟生理环境和不同温度条件下，采用多光谱法、同源模建、分子对接模拟和生物膜（）技术进行研究。荧光猝灭数据结果显示，猝灭速率常数值远大于 ，且猝灭常数 随温度升高而降低，证明槲皮素和 相互作用的猝灭过程为静态猝灭；而热力学参数，焓变、熵变且，表明二者的结合过程是自发、焓驱动的，其相互作用的主要类型为范德华力和氢键作用。通过对槲皮素与 相互作用的同步荧光光谱和三维荧光光谱分析，随着槲皮素的加入，的荧光强度逐渐降低，证明二者之间发生了相互作用。进一步分析发现，同步荧光光谱中槲皮素使 中的芳香族氨基酸残基的最大发射波长发生了轻微红移，周围的微环境极性增强，亲水性增加，表明槲皮素的加入使 的蛋白质构象发生了改变。紫外可见光谱结果显示，与槲皮素之间形成了一个基态复合物，进一步证实了 与槲皮素之间的静态猝灭机制。采用同源模建技术建立 的射线晶体结构模板。分子对接模拟结果显示两者结合力为 。对接结果表明槲皮素结合点位于由 ，和 等 氨 基 酸 形 成 的 活 性 口 袋 中，与 ，和 位点产生范德华力作用，与 ，位点存在氢键作用力。各种作用力影响了 的微环境变化，导致其荧光猝灭，是参与复合物形成的关键因素。最后，利用 技术对槲皮素和 的结合进行定量研究，研究结果显示，二者具有良好的的结合活性，结合解离平衡常数值为 ；其响应信号值随槲皮素浓度的升高而增强，表明 与槲皮素之间存在特异性结合。该研究有助于了解槲皮素与 的相互作用机制，为槲皮素治疗动脉粥样硬化的作用靶点研究提供参考。关键词槲皮素；小窝蛋白；相互作用；多光谱法；同源模建；分子对接；生物膜干涉技术中图分类号：文献标识码：（）收稿日期：，修订日期：基金项目：国家自然科学基金项目（），山西省自然科学基金项目（），山西省高校科技创新基金项目（），人才培养专项计划山西中医药大学青年科学家基金项目（）资助作者简介：侯倩宜，年生，山西中医药大学中药与食品工程学院硕士研究生 ：通讯作者 ：；引言槲皮素（），是一种天然存在的多羟基黄酮类化合物，广泛存在于水果、蔬菜、茶和多种中草药中。槲皮素具有抗炎、抗氧化应激、抗糖尿病、抗高血压和抗癌等多种药理作用，特别是在治疗和预防心血管疾病方面，可发挥降血脂、抑制低密度脂蛋白氧化等保护作用。然而，目前有关槲皮素抗动脉粥样硬化等心血管疾病的作用靶点还不明确。由 基因家族编码的小窝蛋白是细胞膜上负责集中一系列对细胞功能至关重要的信号分子的位点，其中小窝蛋白（，）是小窝表面最具标志性的蛋白，分子量为 ，是细胞膜上信号转导系统中的一种支架蛋白，在多种信号途径中起调节血管内皮等多种功能。内皮细胞功能障碍是动脉粥样硬化病理学的关键潜在原因，作为血管内皮细胞细胞膜上的一种主要的小窝结构蛋白，参与脂蛋白胞吞、血管炎症的调节和动脉粥样硬化的进展。被证实是参与调节内皮导致动脉粥样硬化发展的关键靶点。槲皮素可以调节小窝的功能特性，改变小窝相关信号蛋白的激活，并显示出对血管内皮细胞的保护作用，抑制动脉粥样硬化的早期发展。研究表明，槲皮素调节动脉粥样硬化相关的氧化应激和炎症通路与功能性小窝蛋白相关，可通过调节 及其磷酸化表达来维持氧化应激下内皮细胞功能的水平。本工作采用多光谱、分子对接模拟和生物膜层干涉技术研究槲皮素与 的相互作用机制，从分子结构层面分析槲皮素对 空间结构和氨基酸残基微环境的影响，旨在为阐明槲皮素与 的作用机制及槲皮素治疗动脉粥样硬化等心血管疾病的作用靶点提供重要信息。实验部分 试剂与仪器槲皮素（四川省维克奇生物科技有限公司，）；蛋白（，）；磷酸缓冲盐溶液（）；二甲基亚砜（索莱宝，）；吐温（索 莱 宝，）；超 级 链 霉 亲 和 素（，）；脱盐离心柱（，）；生物素（，）。荧光分 光光度 计（，日立，日 本）；低 温 恒 温 槽（，南京宁凯仪器有限公司）；化学发光荧光酶标仪（，美谷分子）；生物膜干涉分子相互作用仪（，）。实验所用试剂为分析纯，所用水为一级水。荧光猝灭光谱荧光猝灭检测已被广泛应用于研究有机化合物与蛋白质的相互作用。本研究使用荧光分光光度计并采用温度相关的测量方法检测荧光发射光谱来分析槲皮素与 蛋白的相互作用。蛋白（）溶液 溶于毫升 缓冲液中。将不同浓度的槲皮素（，和 ）分别与一定浓度的 蛋白反应。样品检测在荧光分光光度计专用比色皿中进行，在激发波长 ，发射波长 范围内，激发狭缝和发射狭缝宽度均设置为，以 的电压（）及 的扫描速度，设定温度为 和 ，使用循环水浴控制温度，分别扫描获得荧光光谱。同步荧光光谱在 温度下使用相同的溶液进行同步荧光测定，将（波长间隔）参数设置为 ，以筛选微环境中色氨酸残基周围的扰动。一般来说，极性大小或亲水疏水性的变化与最大峰 的 红 移 或 蓝 移 有 关，其 可 影 响 氨 基 酸 周 围 微 环境。于荧光比色皿中加入 和 蛋白溶液混匀，使蛋白终浓度为 ，蛋白浓度保持不变，逐渐加入的槲皮素溶液，以其混合液（，和 ）为样品溶液，扣除空白，在 测定。三维荧光光谱三维荧光光谱是分析蛋白质在溶液状态下构象变化的有效分析技术。设定电压（）为 ，增益为，扫描速度 ，等高线设置为，激发波长参数为 ，发射波长参数为 ，两者扫描间隔均为。以蛋白溶液（）为样品进行扫描，再加入相应化合物（）体系作为样品溶液，扫描获得相应的三维荧光光谱。记录等高线图中特征峰的峰位和峰强度变化。紫外可见吸收光谱室温条件下在 波长范围内测定 溶液（）和槲皮素溶液（）的吸收光谱，以及 与槲皮素摩尔比为:时的吸收光谱。在 吸收测量中，通过单独减去 的 吸收光谱进行背景校正，对这些化合物的 吸收光谱进行了校正。分子对接 的 晶 体 结 构 至 今 尚 未 解 决。蛋 白 质 数 据 库（：）中没有 的晶体结构。为此，采用同源模建的方法为 寻找合适的射线晶体结构模板。登 陆 网 站，输 入 的 序 列 检 索 号 进行检索，找到 的蛋白序列，其蛋白序列如下：（：）是一种用于自动化蛋白质结构预测和基于结构的功能注释的在线分析工具。提交 蛋白的氨基酸序列，模拟生成多个预测模型，根据 提供的置信度分数（）及 挑选合格的模型，获得模型 文件。根据所提供的配体结合位点，与槲皮素进行分子对接模拟。登录 ，上传蛋白文件进行除水、加氢等自动处理，上传 配 体 文 件 并 进 行 加 氢，活 性 位 点 定 义 为“”，整个蛋白被定义为受体，最后采用蛋白的同源模型结构进行了分子对接分析。（亲和力结合能）小于说明槲皮素与 可以自发结合，结合能越小说明两者之间 的 亲 和 力 越 大。采 用 软 件 作 图 进 行 可 视 化研究。分子互作应用生物膜干涉技术检测 与槲皮素体外相互作用，其采用光干涉信号，非标记且实时监测，最大程度保证实验真实性。在 系统中操作进行生物膜层干涉（，）实验，孔黑板中每孔加入的试剂体积为 ，反应温度设置为 。首先选择 （）标记的探针四个，设置没有固化蛋白的对照传感器，减去以改善所研究的特异性结合解离。提前放入 缓冲液中浸湿 ，同时将浓度为第期侯倩宜等：多光谱法、分子对接模拟和生物膜干涉研究槲皮素与小窝蛋白的相互作用 的蛋白与母液浓度为 的生物素化试剂混合进行生物素化，将混合液加入脱盐柱，收集流穿并稀释，获得浓度为 的生物素化的蛋白。准备结束后，基线设置 进行平衡，固定蛋白 ，并重新平衡 建立新的、稳定的基线信号。将探针转移至终浓度依次为 ，和 的槲皮素溶液中进行结合测定，时间。将结合后的探针再次转移到缓冲液中进行解离，时间。基于 原理，以分子间相互作用大小为判断依据，亲和力常数（值）数值越小亲和力越强，而分子浓度不影响其数值变化。从非线性回归后的整体分析进行拟合，基线校正处理后，确定一对结合和解离的速率常数，从而确定一个平衡解离常数，及响应值，卡方（），判断拟合的好坏及可信度。结果与讨论 蛋白 与槲皮素的荧光光谱在 和 条件下，蛋白（）和不同浓度化合物混合液的光谱分别如图（，）所示。蛋白质浓度的变化相对较小，被忽略。从样品测量中减去与 溶液相对应的适当空白，以校正任何背景荧光。随着槲皮素的图 和 下，不同浓度槲皮素对蛋白荧光猝灭光谱（，）（，）：，加入，（发射）几乎没有变化，的荧光强度逐渐降低，表明它们导致蛋白质的荧光被猝灭，符合静态猝灭机制。这种形式的内在荧光猝灭可能归因于 和槲皮素分子的相互作用。为进一步的理论计算提供了依据。荧光猝灭机理为了分析化合物与蛋白的猝灭机制，使用 方程分析化合物和蛋白质的荧光猝灭数据 （）式（）中，和是蛋白的荧光强度和蛋白加入不同浓度的化合物后的荧光强度；是猝灭常数；为猝灭速率常数；是化合物的浓度；是没有淬灭剂的生物分子的平均荧光寿命（）。以对 作图，获得 和 的一系列标准曲线（图）。图 和 下，槲皮素对蛋白的相互作用 由图的 曲线，根据直线的斜率可以得到相应温度下 和的值。结果如表所示。表 和 下不同化合物与蛋白的 和值 （）（）在 和 下，蛋白的 曲线均呈现良好的线性关系，其相关系数分别为 和 。值远大于 ，并且随着温度的升高 呈下降趋势，化合物对蛋白的猝灭机制可能是因二者形成了新的络合物而引起了静态猝灭。结合常数及结合位点数根据结合常数和温度之间的关系来区分动态和静态猝灭。在络合物形成（即静态结合）的情况下，温度的升高可导致结合常数的减小，而在动态结合的情况下，温度的升高导致结合常数的增大。对于静态猝灭，结合常数和结合位点光谱学与光谱分析第 卷由式（）计算。（）式（）中，和是蛋白的荧光强度和加入不同浓度化合物后的荧光强度；是此反应中的结合常数，为此反应中的结合位点数。以 （）为纵坐标 为横坐标作图，得到一系列在 和 下的标准曲线（图）。图化合物与蛋白的结合常数与结合位点数图 由 （）对 图，得到相应温度下的和值。见表。表 和 下不同化合物与蛋白的和值 （）由于槲皮素对 的静态猝灭作用，随着温度升高，结合常数变小。化合物与蛋白质的结合位点受温度影响不大，说明化合物与蛋白质之间有很强的结合力，从值可以看出，化合物与蛋白质结合时至少有一个结合位点。热力学参数和相互作用力进一步计算与结合相互作用相关的热力学参数以确定促进配体蛋白质形成的主要作用力。一般来说，药物与生物分子结合所涉及的各种结合力包括静电力、氢键、疏水相互作用（包括 、烷基、酰胺）和范德华相互作用。通过使用 方程获得熵变（）、焓变（）和自由能变（）的值，分别见式（）式（）。小分子与蛋白质之间的主要作用力可以根据和的相对大小获得。结果见表。（）（）（）（）式（）式（）中，为绝对温度（和 ），为温度下的结合常数，为气体常数（）。表 和 下不同化合物与蛋白的热力学参数 （）（）（）据相关研究，当和，相互作用力主要为疏水作用力；当和，相互作用力主要为氢键、范德华力或质子化作用力；当和，相互作用力主要为静电作用力。槲皮素与 反应的，和均为负值，表明结合过程是自发和焓驱动的，其主要作用力是氢键和范德华力。发射波长的变化按 方法测定，当 时，以扫描波长和荧光强度分别为横纵坐标，得到一系列蛋白质加入不同浓度化合物后的荧光曲线（图）。从图可以看出，随着槲皮素的加入，化合物的浓度增高，蛋白质的荧光强度降低，并且最大发射波长发生了轻微红移。可见，槲皮素的加入使 构象发生改变，同时 所在的微环境发生变化，极性增加，疏水性降低。进一步证明槲皮素与 结合为静态猝灭。图槲皮素的加入对色氨酸微环境的影响 ：，槲皮素对蛋白三维荧光光谱的影响等高线图中指纹线（，）处为蛋白质肽链骨架的振动特征峰，等高线图中指纹线（，）是酪氨酸和色氨酸残基的特征峰。加入槲皮素前后 的三维荧光光谱如图（，）所示。光谱图坐标轴分别表示激发波长（）、发射波长（）和荧光强度。从三维荧光