大豆细胞核雄性不育基因MS...的功能验证及不育新种质创制_张万年.pdf

植物遗传资源学报 2023，24（3）：801-807DOI：10.13430/ki.jpgr.20221030001Journal of Plant Genetic Resources大豆细胞核雄性不育基因MS6的功能验证及不育新种质创制张万年1，2，杨静3，杨绪磊2，高萌萌2，林春晶2，刘鹏1，李志刚1，杨向东3，张春宝1，2（1内蒙古民族大学农学院，通辽 028042；2吉林省农业科学院大豆研究所，长春 130033；3吉林省农业科学院农业生物技术研究所，长春 130033）摘要：杂种优势利用是显著提高作物产量的有效途径之一，其中不育系的创制与利用，对作物杂交种的选育及生产起着至关重要的作用。基于细胞核雄性不育基因的作物杂交育种技术与传统杂交育种技术相比，具有制种安全、组合自由、杂交种育性稳定等优点，已在玉米、水稻等作物中广泛应用，这为大豆杂种优势利用提供了新思路。前期在大豆中图位克隆了1个编码R2R3-MYB转录因子的细胞核雄性不育基因MS6，本研究在此基础上，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，设计两个基因编辑靶点，在大豆品种Williams82中对MS6基因进行敲除；进一步通过对转基因后代植株的表型观察、花粉及育性鉴定、基因敲除位点分析，验证MS6基因调控大豆花粉形成及雄性育性的功能，最终获得稳定遗传的大豆ms6核不育新种质。这为进一步建立基于MS6基因的大豆第3代杂交育种技术系统，实现强优势杂交种的高效创制，提供了理论和技术参考。关键词：大豆；细胞核雄性不育；不育基因；基因编辑；杂交育种Functional Identification of a Nuclear Male Sterility Gene MS6 and Creation of New Sterile Germplasms in SoybeanZHANG Wan-nian1，2，YANG Jing3，YANG Xu-lei2，GAO Meng-meng2，LIN Chun-jing2，LIU Peng1，LI Zhi-gang1，YANG Xiang-dong3，ZHANG Chun-bao1，2（1College of Agriculture，Inner Mongolia Minzu University，Tongliao 028042；2Soybean Research Institute，Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130033；3Institute of Agricultural Biotechnology，Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130033）Abstract：Heterosis utilization is one of the effective ways to significantly increase crop yield，in which the creation and utilization of sterile lines plays a vital role in the breeding and production of crop hybrids.In contrast to the traditional hybrid breeding technology，the third generation crop hybrid breeding technology based on the nuclear male sterility gene has layers of advantages such as safety on seed production，flexibility on bi-parental combinations，and stability on hybrid fertility.This technology has been widely used in maize，rice and other crops，and provides a possibility in future use of soybean heterosis.We previously mapped by positional cloning approach a nucleic male sterility gene MS6 that encodes an R2R3-MYB transcription factor in soybean.In this study，we deployed CRISPR/Cas9 gene editing technology to design two gene editing targets to knock out the MS6 gene in soybean variety Williams82.The transgenic plants carrying edited MS6 alleles were subjected for 收稿日期：2022-10-30 修回日期：2022-11-13 网络出版日期：2022-12-10URL：https：/doi.org/10.13430/ki.jpgr.20221030001第一作者研究方向为大豆杂种优势利用，E-mail：通信作者：张春宝，研究方向为大豆杂种优势利用，E-mail：杨向东，研究方向为大豆生物技术，E-mail：基金项目：吉林省科技发展计划项目（20210302005NC）；国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-04）；吉林省农业科技创新工程（CXGC2021ZD002，CXGC2022RCY010）Foundation projects：Science and Technology Development Plan Project of Jilin Province（20210302005NC）；Earmarked Fund for China Agriculture Research System（CARS-04）；Agricultural Science and Technology Innovation Project of Jilin Province（CXGC2021ZD002，CXGC2022RCY010）植物遗传资源学报24 卷phenotype observation，pollen and fertility identification，thus approving the function of this gene in regulating soybean pollen formation and male fertility.A new ms6 germplasm showing stable male sterility was obtained in soybean.This provides theoretical and technical support for further establishing the third generation soybean hybrid breeding technology system based on MS6 gene and realizing the efficient creation of strong heterosis hybrids.Key words：soybean；nuclear male sterility；sterile gene；gene editing；hybrid breeding杂种优势是指遗传基础有差异的亲本杂交生成的杂合子在生长势、生物量、抗逆性和适应性等方面优于亲本的现象1。与传统育种相比，种植杂交种显著提高了水稻、玉米和油菜等作物的产量，可达15%50%2。大豆（Glycine max（L.）Merr.）是我国重要的粮、油和饲用作物，同样存在较强的杂种优势。1993年，孙寰等3育成了世界上第一个大豆细胞质雄性不育系，1995年实现“三系”配套。基于“三系法”于2002年在吉林省审定了第一个大豆杂交种“杂交豆1号”4。经过了30多年的发展，目前全国审定的大豆杂交种已达30余个5，但受限于亲本种质资源利用范围狭窄、不育系转育周期长、杂交种育性易受环境条件影响等瓶颈，尚未实现产业化推广。基于细胞核雄性不育基因的杂交育种技术，由于拓宽了亲本的选择范围，且不受环境条件制约，作为作物杂种优势利用的新途径，在玉米6和水稻7-8等作物中已成功建立并实现育种应用，这为在大豆上开展相关研究和应用提供了理论和技术支撑。目前，在大豆中已克隆的细胞核雄性不育基因有MS1、MS3和MS4。其中，MS1基因编码1个定位于细胞核的驱动蛋白（Kinesin），在花药减数分裂末期参与细胞板的形成；通过对CRISPR/Cas9基因敲除材料的表型分析发现，突变体的花粉粒变大并呈败育表型9-11。MS3基因则编码1个PHD-finger蛋白，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对MS3进行敲除，T2代转基因阳性植株表现出完全不育特征；进一步对不同纬度及短日照处理的ms3突变株的结荚表型进行鉴定发现，在长日照条件下，ms3突变株育性得到恢复，表明MS3可能是1个光敏核不育基因12。MS4基因同样编码1个PHD-finger蛋白，其在花芽分化阶段具有更高的表达量，可以互补拟南芥mmd1不育突变体，使其形成正常可育的花粉和种子13。前期通过构建高代回交群体、BSA 测序及SSR分子标记分析，将大豆核不育基因MS6定位于13号染色体的SSR标记BARCSOYSSR_13_0257和BARCSOYSSR_13_0259 之间的 255 kb 区域内，通过编码序列比对分析，推断Glyma.13G066600为大豆MS6候选基因14。MS6基因在大豆花药中高表达，其编码1个R2R3-MYB转录因子，在N端的第39146位氨基酸残基之间分别包含1个R2-MYB和R3-MYB保守结构域，该转录因子与拟南芥绒毡层发育基因AtTDF1为同源基因；通过对MS6候选基因的生化分析及在拟南芥attdf1突变体中的互补试验验证，明确了Glyma.13G066600为大豆细胞核雄性不育基因 MS615。本研究将在此基础上，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在大豆中对MS6基因进行敲除，通过对转基因后代植株的表型观察、花粉育性鉴定及基因敲除位点分析，验证MS6基因功能，并获得稳定遗传的大豆 ms6 核不育新种质ms6cr-1和ms6cr-2，为进一步建立以MS6基因为核心元件的大豆第3代杂交育种技术系统，提供理论和技术支撑。1材料与方法1.1试验材料与试剂大豆材料 Williams 82、Nuclean Plant Genomic DNA Kit 试剂盒、pEASY-T1 Cloning Kit 试剂盒、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、大肠杆菌DH5、农 杆 菌 EHA101、Cas9 载 体 pYLCRISPR/Cas9P35S-B、gRNA载体pYLsgRNA-AtU3b、pYLsgRNA-AtU6-1、Bsa I、T4 DNA ligase、卡那霉素等由吉林省农业科学院杂交大豆研究团队保存和提供。1.2CRISPR/Cas9-MS6载体构建1.2.1 gRNA 靶 位 点 的 选 择 利 用 在 线 软 件MMEJ-KO（http：/ 行靶位点的选择，筛选出两个打靶效率高的靶点，分别位于MS6基因的第一和第二外显子，命名为ms-T1 和 ms-T2。ms-T1 的 snRNA 启动子选用 AtU3b，ms-T2 的 snRNA 启动子选用 AtU6-1。同时设计启动子接头的两对引物，引物分别命名为MS6T1和MS6T2（表1）。1.2.2 sgRNA表达盒的构建及连接 参照Ma等