低浓度硫酸阿托品滴眼液兔眼毒性试验研究_郭妍.pdf

用药学，2003(06):464-466.5 董碧莲，蔡延渠，吕莉，等.中药多糖增强免疫、抗疲劳作用的研究进展 J.中成药，2019，41(05):1119-1124.6 李容，陈华国，周欣.植物多糖免疫调节机制研究进展 J.天然产物研究与开发，2018，30(11):2017-2022，2031.7 鲍智娟，王惠杰.不同方法提取益母草多糖的比较研究 J.白城师范学院学报，2016，30(08):40-45.低浓度硫酸阿托品滴眼液兔眼毒性试验研究郭妍，安元龙，张智鹏，姜珊*，马俊佼，钟梦婷(辽宁何氏医学院药学院，辽宁沈阳 100163)摘要:目的通过急性眼毒性试验和长期眼毒性试验，评价低浓度硫酸阿托品滴眼液(0.01%)对兔眼的安全性，同时为 0.01%0.1%浓度范围硫酸阿托品滴眼液的开发提供理论支撑。方法采用定期测量瞳孔直径、眼压、眼部 A 超、眼底彩超、裂隙灯眼表检查及组织病理学作为观察指标，评价低浓度硫酸阿托品对兔眼急性毒性。结果未见该药物对兔眼产生毒性反应。结论低浓度硫酸阿托品滴眼液安全性较高，0.01%0.1%浓度范围硫酸阿托品滴眼剂可进一步开发。关键词:低硫酸阿托品滴眼液;急性眼毒性试验;长期眼毒性试验中图分类号:965文献标识码:A文章编号:1006-3765(2023)-02-0017-04作者简介:郭妍，女(1984 )。学历:硕士研究生。职称:副教授。主要从事药品质量及药理毒理研究。通讯作者:姜珊。职称:副教授。基金项目:辽宁省教育厅科学研究经费项目(No.SJ202002)Study on the Ocular Toxicity of Low Concentration of Atropine Sulfate EyeDrops in abbitsGUO Yan，AN Yuan-long，ZHANG Zhi-peng，JIANG Shan*，MA Jun-jiao，ZHONG Meng-ting(School ofPharmacy，He University of Liaoning，Shenyang 110163，China)ABSTACT:OBJECTIVEThe safety of atropine sulfate eye drops with low concentration(0.01%)on rabbiteyes was evaluated through acute and long-term eye toxicity tests，and theoretical support was provided for the devel-opment of atropine sulfate eye drops with concentrations ranging from 0.01%to 0.1%.METHODSThe pupil di-ameter，intraocular pressure，ocular A ultrasound，fundus color ultrasound，slit lamp ocular surface examination and his-topathology were measured regularly as observation indicators to evaluate the acute toxicity of atropine sulfate at lowconcentration to rabbit eyes.ESULTSNo toxic reaction in rabbit eyes was observed.CONCLUSIONLow con-centration atropine sulfate eye drops are safe，and the concentration range of 0.01%-0.1%can be further developed.KEY WODS:Atropine sulfate eye drops;Acute ocular toxicity test;Long-term ocular toxicity test目前控制近视进展的方法中，低浓度阿托品对青少年近视的延缓作用备受医学界关注。研究报道1-3，硫酸阿托品滴眼液控制近视进展的疗效与浓度有关，目前 0.1%、0.05%、0.025%、0.02%、0.01%浓度硫酸阿托品滴眼液报道最多，其中 0.01%浓度控制近视进展的效果较好。Sun 等4研究表明，低浓度阿托品滴眼液控制儿童近视进展的有效性具有剂量依赖性。赵兵新等5通过对 0.005%硫酸阿托品滴眼液临床有效性和安全性研究得出，0.005%硫酸阿托品滴眼液对延缓儿童近视临床效果不明显，建议从略高质量分数如 0.01%开始。本实验旨在评价 0.01%硫酸阿托品滴眼液非临床安全性。项目组选择 0.01%和 0.1%两个浓度开展阿托品滴眼液急性眼毒性实验和长期眼毒性试验，考察低浓度阿托品滴眼液对兔眼的毒性反应，为后续研究不同浓度阿托品滴眼液控制近视奠定研究基础。1材料与方法1.1药品、试剂与仪器硫酸阿托品滴眼液(沈阳何氏眼产业集团有限公司提供，0.01%浓度，批号:20210301;0.1%浓度，批号 20210401);0.5%盐酸丙美卡因滴眼液(爱尔凯因，18C16N);HE 染色试剂盒(碧云天生物技术有限公司，P0098);中性树脂(北京索莱宝科技有限公司);0.9%氯化钠注射液。眼科裂隙灯(重庆康华科技有限公司，SLM 型);手持式眼底照相机(苏州微清医疗器械有限公司);接触式眼压计71Strait Pharmaceutical Journal Vol.35 No.2 2023(瑞士 i-care);眼 A/B 超仪(索维 SW-2100);瞳孔测量卡尺;轮转式切片机(徕卡显微系统有限公司);自动包埋机(LEICACM1860);正置荧光显微镜(Nikon ECLIPSE Ni)。1.2实验动物选取健康幼年大耳白兔 30 只6，雌雄各半，体重 1.4 2.0 kg，辽宁长生生物股份有限公司提供，许可证号:NO.SCXK(辽)2020-0001。由辽宁何氏医学院动物实验中心饲养，室内温度 25 左右、相对湿度 50%60%、光照12 h/12 h 昼夜循环;实验动物自由摄食、生存环境适宜。经一般健康检查和眼科基础检查合格的大耳白兔，进入适应期观察。实验过程中项目组自觉遵守实验动物福利伦理相关法规和各项规定，并接受伦理委员会和实验动物室管理者的监督与检查。1.3急性眼毒性试验1.3.1分组方法:选取 15 只大耳白兔，随机分成 3 组:空白对照组(N)，给药组为 0.01%浓度组(L)和 0.1%浓度组(H)，每组 5 只，并进行耳孔标识和笼卡标识。1.3.2给药方法:0.01%浓度组和 0.1%浓度组分别滴入0.01%和 0.1%硫酸阿托品滴眼液，空白对照组滴入 0.9%生理盐水。每组兔双眼结膜囊给药，1 次 0.05 mL，轻合眼睑约10 秒。连续给药 2 h，每次间隔 15 min。于给药后第 1 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 进行眼压、瞳孔直径、眼表检查和眼底检查。在最后一次检测完成后，摘取眼球，观察眼部是否有病理性变化。1.4长期眼毒性试验1.4.1分组方法:选取 15 只大耳白兔，分组方法同“1.3”项下分组方法。1.4.2给药方法:每组用药同“1.3”项下给药方法。各组于每日 900、1500 两个时间点给药，连续给药 4 周。每 1 周进行1 次眼部检测，包括眼压、瞳孔直径、眼部 A 超、眼表检查和眼底检查。在最后一次检测完成后，摘取眼球，观察眼部是否有病理性变化。1.5检测方法1.5.1瞳孔直径测定:使用瞳孔测量尺测量兔双眼瞳孔直径，并记录数据。1.5.2眼压测定:首先在兔眼球表面滴入 1 滴盐酸丙美卡因滴眼液，进行眼表麻醉，然后使用接触式眼压计进行兔双眼眼压测定，每只眼测定 3 次，要求 3 次测量值置信区间为 95%，记录每组数据，结果取其平均值。1.5.3眼部 A 超:兔眼球表面滴入 1 滴盐酸丙美卡因滴眼液进行眼表麻醉后，使用眼 A/B 超仪测定兔眼中央前房深度(ACD)、晶体厚度(LENS)、玻璃体腔长度(VIT)、眼轴长度(AL)，通过测量数值判断硫酸阿托品滴眼液对眼部的影响。1.5.4眼表检查:兔眼表麻醉后，使用眼科裂隙灯对兔眼进行眼表拍照，观察兔眼瞳孔边界是否清晰，角膜是否平滑、透明，结膜是否充血，前房及晶体是否出现浑浊。1.5.5眼表刺激性:根据 化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则 眼刺激反应分值标准，将每一个观察时间每一动物的眼角膜、虹膜和结膜的刺激反应分值相加得总积分，将一组的积分总和除以动物数，即得最后分值;积分 03 为无刺激性，4 8 分为轻度刺激性，9 12 分为中度刺激性，13 16 分为强度刺激性。本实验中急性眼毒性试验组在给药后观察 1 周内兔眼刺激反应，长期眼毒性试验组于每周观察一次兔眼刺激性反应。详细记录每次检查兔眼部异常反应，根据眼刺激反应分值标准计算眼刺激反应分值，判断眼刺激程度。1.5.6眼底检查:兔眼表麻醉后，使用手持式眼底照相机进行眼底拍照，观察兔眼玻璃体腔是否浑浊，眼底是否充血，视盘边界和动静脉走形是否清晰。1.5.7病理检查:将新鲜眼球组织取下后放入眼球固定液Davidoson 液中固定 72 h，眼球固定液=115(体积比)，使眼球完全被浸没且能自由移动。固定完成后，沿眼球矢状面切开，将组织结构相对完整的一半置于包埋盒中进行脱水。系列溶剂按时间先后排序分别为 70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、二甲苯、石蜡。各溶剂中分别放置40 min，以确保脱水完全。完成脱水、石蜡包埋冷冻后，即可使用轮转式切片机进行 5 m 厚度切片。切片铺展于载玻片，置烘干机烘干。HE 染色前需要完成脱蜡复水，使用上述系列溶剂，排序需倒置，从二甲苯至 70%乙醇，各溶剂中分别放置 5 min，以去除石蜡，便于染色。苏木素和伊红分别染色后，进行脱水，使用中性树脂封片，正置显微镜下观察，400观察，采用 Nikon NIS Elements 图像分析系统观察角膜、结膜、虹膜、视网膜等组织结构变化情况。1.6统计学分析应用统计分析软件 GraphPad Prism 8 和Microsoft Excel 2010 进行数据处理分析，定量资料采用均数 标准差(x s)表示。2结果2.1瞳孔直径急性眼毒性试验中，给药前兔眼瞳孔直径平均值在(6.75 0.51)mm，与给药前及空白对照组相比，0.01%浓度组和 0.1%浓度组兔眼瞳孔直径在给药后逐渐增大，于 2 h 达到峰值，4 h 内能维持较高散瞳状态，瞳孔直径平均值为(9.74 0.44)mm，兔眼瞳孔直径随给药时间的变化情况见图 1。实验结果表明:0.01%浓度组和 0.1%浓度组均能在给药后 2 6 h 内，发挥散瞳作用，说明药物正常发挥药效。在此基础上，对硫酸阿托品滴眼液眼部刺激性和毒性反应进行评价与分析。图 1瞳孔直径81海峡药学2023 年第 35 卷 第 2 期2.2眼压急性眼毒性试验中，给药前兔眼平均眼压为(10.56 0.44)mmHg，给药后连续监测 72 h，监测药物对兔眼压的影响。数据统计分析结果见表 1。结果表明，给药组与空白对照组比较，P 0.05，无统计学意义，说明低浓度硫酸阿托品滴眼液对正常眼眼压无影响，未造成眼压升高或降低。表 1眼压变化情况(x s，mmHg)组别0 h1 h2 h4 h6 h12 h24 h48 h72 hN10.12 1.2811.33 1.2511.67 0.8911.00 1.3010.67 1.4511.82 1.2612.42 1.0110.89 2.1510.24 0.95L11.01 1.6510.72 1.3010.96 1.2412.06 1.5211.00 1.