大豆GmGolS基因高温胁迫应答及启动子活性分析_张军.pdf

大 豆 科 学 Soybean Sciencehttp:/ddkx haasep cn2023，42(2):188-193DOI:10 11861/j issn 1000-9841 2023 02 0188大豆 GmGolS 基因高温胁迫应答及启动子活性分析张军1，翟莹2，邱爽2，尹珺伊1，张艳1，金振华1，张勇3，王丽坤1(1 黑龙江省农业科学院 畜牧兽医分院，黑龙江 齐齐哈尔 161005;2 齐齐哈尔大学 生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006;3 黑龙江省农业科学院 克山分院，黑龙江 齐齐哈尔 161606)摘要:肌醇半乳糖苷合成酶(GolS)是棉子糖系列寡糖(FOs)生物合成途径中的关键酶。为探究大豆 GmGolS 基因的高温胁迫调控机制，通过实时荧光定量 PC 检测 GmGolS 在高温胁迫下的表达量，通过 PC 从大豆基因组 DNA 中扩增 GmGolS 基因启动子序列，将其连接到植物表达载体 pCAMBIA1301 上并转化烟草，通过 GUS 组织化学染色和实时荧光定量 PC 检测 GmGolS 启动子的高温诱导启动活性。结果表明:高温胁迫可以强烈诱导 GmGolS 的表达。1 739 bp 的 GmGolS 启动子序列中含 1 个生长素响应元件、1 个干旱诱导的 MYB 转录因子结合位点、2 个厌氧诱导元件、1 个防御和胁迫响应元件、1 个脱落酸响应元件、1 个茉莉酸响应元件和 1 个缺氧诱导元件。成功获得 3 棵GmGolSP 转基因烟草植株。GmGolS 启动子的活性可以被高温胁迫诱导。关键词:大豆;GmGolS;诱导型启动子;肌醇半乳糖苷合成酶;高温胁迫收稿日期:2022-10-18基金项目:齐齐哈尔市科技计划创新激励项目(CNYGG-2022021);黑龙江省省属高等学校基本科研业务费科研项目(145109506)。第一作者:张军(1982)，男，硕士，助理研究员，主要从事分子遗传育种研究。E-mail:307906439 qq com。通讯作者:翟莹(1982)，女，博士，教授，主要从事植物分子遗传育种研究。E-mail:fairy39809079126 com。esponse of Soybean GmGolS Gene to Heat Stress and Promoter Activity AnalysisZHANG Jun1，ZHAI Ying2，QIU Shuang2，YIN Jun-yi1，ZHANG Yan1，JIN Zhen-hua1，ZHANG Yong3，WANG Li-kun1(1 Branch of Animal Husbandry and Veterinary，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Qiqihar 161005，China;2 College of Life Science andAgro-Forestry，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China;3 Keshan Branch，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Qiqihar 161606，China)Abstract:Galactinol synthase(GolS)is a key enzyme in the biosynthesis pathway of raffinose family oligosaccharides(FOs)In order to explore the regulatory mechanism of soybean GmGolS under heat stress，we used real-time fluorescencequantitative PC to detect GmGolS expression under heat stress，amplified GmGolS promoter sequence by PC from soybeangenomic DNA，constructed GmGolS promoter into plant expression vector pCAMBIA1301 and transformed into tobacco GUShistochemical staining and real-time fluorescence quantitative PC were used to detect the heat-induced activation activity ofGmGolS promoter The results showed that the expression of GmGolS was significantly induced by heat stress The 1 739 bpGmGolS promoter sequence contained one auxin response element，one drought-induced MYB transcription factor binding site，two anaerobic-induced elements，one defense and stress response element，one abscisic acid response element，one jasmonicacid response element and one anoxic-induced elementWe obtained three GmGolS promoter transgenic tobacco plantssuccessfully The activation activity of GmGolS promoter could be induced by heat stressKeywords:soybean;GmGolS;inducible promoter;galactinol synthase;heat stress棉子糖系列寡糖(raffinose family oligosaccharides，FOs)是一种非结构性和水溶性碳水化合物，它们广泛分布于高等植物中1。作为一种可溶性小分子，FOs 在植物非生物胁迫适应过程中起着重要作用。肌 醇 半 乳 糖 苷 合 成 酶(galactinol synthase，GolS)被认为是 FOs 生物合成过程中的一种关键调节酶，它的活性决定了 FOs 的积累水平2。GolS 基因已被广泛研究，它们往往在植物应对不同逆境条件时发挥作用，过表达 GolS 基因能够提高植物对不同非生物胁迫的耐受性。例如，过表拟南芥AtGolS1 可以提高转基因植株耐热性3，异源表达沙冬青 AnGolS1 可以提高转基因番茄耐寒性4，异源表达盐芥 TsGolS2 可以提高转基因拟南芥耐盐性5，异源表达大豆 GmGolS1 和 GmGolS2-1 则分别提高转基因烟草耐热性和耐旱性6-7。基因的启动子是调控基因表达的重要顺式作用元件，它通常位于基因的 5端，通过与 NA 聚合酶及其他转录因子蛋白结合起始基因转录，从而决定了基因表达强度及时空情况8。对基因启动子调控机制进行研究也有利于该基因功能的鉴定。研究发现，玉米 ZmGolS2 受高温胁迫诱导表达，其启动子上存在热激响应元件，删除后 ZmGolS2 失去热激响应能力9。毛果杨 PtrGolS3 启动子中含有多种逆境相关顺式作用元件，将其过表达后可以提高胁迫相关基因的表达，积累更多的可溶性糖，进而赋予转基因植物耐盐性10。2 期张军等:大豆 GmGolS 基因高温胁迫应答及启动子活性分析189目前鲜有大豆 GolS 基因启动子功能的相关报道。本课题组前期通过实时荧光定量 PC 检测发现大豆 GmGolS 基因能够被干旱、高盐和低温胁迫诱导表达，尤其在干旱胁迫下其表达量可以提高155 倍11。本研究进一步对 GmGolS 基因在高温胁迫下的表达量及 GmGolS 启动子的高温诱导启动活性进行分析，以期为 GmGolS 基因的抗逆机制研究及 GmGolS 启动子在大豆抗逆基因工程育种中的应用提供理论依据。1材料与方法1 1材料供试大豆为北豆 9 号，烟草为 NC89。大肠杆菌DH5 菌株和根癌农杆菌 EHA105 菌株均由齐齐哈尔大学植物分子育种研究室提供。1 2实验设计采用实时荧光定量 PC 方法检测 GmGolS 基因在高温胁迫下的表达量。从大豆叶片基因组 DNA中克隆 GmGolS 基因启动子序列，使用在线软件预测启动子序列中的逆境相关顺式作用元件。构建GmGolS 启动子 植 物 表 达 载 体 并 转 化 烟 草。对GmGolS 启动子转基因烟草进行高温处理，通过 GUS组织化学染色和实时荧光定量 PC 检测 GmGolS 启动子的活性。1 3方法1 3 1大豆幼苗高温处理及基因表达量检测参照邱爽等11 方法水培大豆幼苗。将第一片三出复叶完全展开的大豆幼苗放置于 42 培养箱中6，9，在 0 h(未处理)及高温处理后1，2，5 和10 h 分别称取 0 1 g 大豆幼苗第一片三出复叶，提取 NA 并反转录9，采 用 实 时 荧 光 定 量 PC 方 法9 检 测GmGolS 基因在高温胁迫下的表达量。1 3 2启动子克隆及预测分析通过在线数据库GmGDB(http:/www plantgdb org/GmGDB/)搜索GmGolS 基因(Genebank 登录号:NM001251098)起始密码子上游 1 739 bp 启动子序列。利用 Primer 5软件设计引物，以大豆基因组 DNA 为模板扩增GmGolS 启 动 子 序 列(GmGolSP)。上 游 引 物 为5-GTCGACAGGATTTAGTAACGTAGGGCC-3，下 游引物为 5-CCATGGGATCTCAGTGATGATGAGTGAG-TAG-3，下划线分别代表限制性内切酶位点 Sal 和 Nco。PC 扩增产物与克隆载体 pMD18-T(Takara 公司)连接后送上海生工公司测序。测序后 的 启 动 子 序 列 提 交 PlantCAE(http:/bioinformaticspsbugentbe/webtools/plantcare/html/)在线数据库进行顺式作用元件预测分析。1 3 3植物表达载体构建及烟草遗传转化使用限制性内切酶 Sal 和 Nco 分别对已构建的pMD18-T-GmGolSP载 体 和 植 物 表 达 载 体pCAMBIA1301 进行双酶切，回收酶切产物使用 DNALigation Kit(Takara 公司)连接。采用热激法12 将构建好的重组载体 pCAMBIA1301-GmGolSP 转化至农杆菌 EHA105，采用叶盘法13 转化至烟草。在 MS培养基中添加 8 mg L1潮霉筛选烟草愈伤组织，以抗性烟草转化苗叶片基因组 DNA 为模板，通过PC12 筛选 T0代阳性转基因烟草植株。1 3 4GUS 基因表达量检测将野生型烟草和56 d的 T1代转基因烟草置于 42 培养箱中进行高温处理。分别剪取未处理和高温处理 2 h 的烟草叶片，加入 GUS 染色液进行 GUS 组织化学染色，37 温育过夜，75%乙醇脱色至底色完全消失14。参照邱爽等11 实时荧光定量 PC 方法检测处理前及高温处理后转基因烟草中 GUS 基因的表达量。GUS基因上游扩增引物为 5-GATCGCGAAAACTGTG-GAAT-3，下游扩增引物为 5-TAATGAGTGACCG-CATCGAA315。1 3 5数据分析使用 Excel 2010 绘制基因表达量柱状图，使用 Students t 检验法进行差异显著性分析。2结果与分析2 1高温胁迫下 GmGolS 表达分析高温胁迫处理后 GmGolS 的表达情况如图