改良型与可注射型富血小板纤...成纤维细胞增殖及分化的影响_唐一月.pdf

北京口腔医学 2023年第31卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2023，Vol.31，No.16改良型与可注射型富血小板纤维蛋白对人牙龈成纤维细胞增殖及分化的影响唐一月 曹春花 常尧仁【摘要】目的 探究改良型富血小板纤维蛋白（advanced platelet-rich fibrin,A-PRF）和可注射型富血小板纤维蛋白（injectable platelet-rich fibrin,i-PRF）对人牙龈成纤维细胞增殖及分化的影响，为两种血小板纤维蛋白制品促进软组织愈合的表观差异及临床效能评估提供实验数据参考。方法 观察 A-PRF 及 iPRF 显微及超微结构,测定血小板浓缩物生长因子（PDGF-BB，TGF-1，EGF）的释放情况，将 A-PRF 及 i-PRF 作用于人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts,HGFs），观察两者对 HGFs 的增殖影响及 HGFs I 型胶原蛋白（COL1）的表达情况，通过 qRT-PCR 进一步检测 I 型胶原蛋白 2（COL12）、纤连蛋白 I（FN1）、转移生长因子（TGF-）、血小板衍生生长因子（PDGF）基因的表达。结果 i-PRF 中白细胞层较 A-PRF 更宽，且白细胞数量更多，而A-PRF 的纤维网状结构更为致密。A-PRF、i-PRF 中的细胞因子随着时间的延长，在各时间点释放量逐渐降低，A-PRF 中 TGF-1 在第 1 天及 EGF 在第 7 天释放量低于 i-PRF，其余各个时间点 A-PRF 生长因子的释放量均高于 i-PRF（P0.05），A-PRF 及 i-PRF 均对 HGFs 的增殖具有显著促进作用，差异无统计学意义。A-PRF 对 TGF-、PDGF 基因的上调作用更加明显，而 i-PRF 对 HGFs I 型胶原蛋白及 COL1a2、FN1 基因的上调作用更为明显。结论 A-PRF、i-PRF 均对 HGFs 的增殖具有明显的促进作用，且二者对 HGFs I 型胶原蛋白的表达起到了显著促进作用，在同一时间段 A-PRF 可分泌更多的软组织愈合相关生长因子，提示A-PRF 在促进软组织修复愈合方面表现更优。【关键词】改良型富血小板纤维蛋白；可注射型富血小板纤维蛋白；牙龈成纤维细胞【中图号】R329.2【文献标识码】A【DOI】10.20049/j.bjkqyx.1006-673X.2023.01.002Effect of advanced platelet-rich fibrin and injectable platelet-rich fibrin on the biological properties of human gingival fibroblasts TANG Yi-yue,CAO Chun-hua,CHANG Yao-ren.Department of Stomatology,Luchaogang Community Health Service Center of Pudong New District,Shanghai 201306,China【Abstract】Objective To investigate the effects of advanced platelet-rich fibrin(A-PRF)and injectable platelet-rich fibrin(i-PRF)on the proliferation and differentiation of human gingival fibroblasts.Methods The microstructure and ultrastructure of A-PRF and iPRF were observed and the release of platelet concentrate growth factors(PDGF-BB,TGF-1,EGF)was determined.A-PRF and i-PRF were applied to human gingival fibroblasts(human gingival fibroblasts,HGFs).The effects of A-PRF and iPRF on the proliferation of HGFs and the expression of HGFs type I collagen(COL1)were observed,and type I collagen 2(COL12)and fibronectin I(FN1),transfer growth factor (TGF-)and platelet-derived growth factor(PDGF)gene expression were further detected by qRT-PCR.Results The white blood cell layer in i-PRF was wider than that in A-PRF,and the number of white blood cells was larger.The cytokines in A-PRF and i-PRF increased with time.The release volume of TGF-1 in A-PRF on the 1st day and EGF release on the 7th day were lower than that of i-PRF,and the release volume of A-PRF growth factor at each time point was higher than that of i-PRF(P0.05).A-PRF and i-PRF both had a significant promotion effect on the proliferation of HGFs.A-PRF had a significant effect on TGF-and PDGF genes.The up-regulation effect of i-PRF on HGFs type I collagen,COL1a2 and FN1 genes was more obvious.Conclusions Both A-PRF and i-PRF can significantly promote the proliferation of HGFs and the expression of HGFs type I collagen.A-PRF is better in promoting soft tissue repair and healing.【Key words】Advanced platelet-rich fibrin;Injectable platelet-rich fibrin;Gingival fibroblast近年来，随着组织工程的发展，富血小板纤维蛋白（PRF）受到越来越多的关注。PRF 具有良好的立体纤维空间结构1，有效地促进细胞的迁移与增殖，为种子细胞提供理想的细胞支架和适宜的生长环境，从而达到促进伤口愈合的作用2。A-PRF技术是 2013 年 Choukroun 教授在 PRF 技术上改进发明的新一代血液离心制备技术，它在引导组织再基金项目：上海市第六人民医院院人才基金（DY2019012）作者单位：201306 上海 上海市浦东新区芦潮港社区卫生服务中心口腔科（唐一月）；上海交通大学医学院附属第六人民医院口腔科（常尧仁）通信作者：常尧仁，E-mail：，电话：15316986844北京口腔医学 2023年第31卷第1期 Beijing Journal of Stomatology February 2023，Vol.31，No.17生领域中有重大的意义3。i-PRF 技术是使用特制的离心管以及特定的制备程序获得的具有高浓度白细胞含量的血液浓缩制品，其成分中含有大量的白细胞，可缓慢释放多种生长及免疫调节因子，对促进伤口愈合具有一定的应用潜力4。HGFs 是牙龈结缔组织和牙周膜的主要细胞类型,能够产生胶原、糖蛋白等结缔组织基质、决定着牙龈的形态和生理特点，在牙周组织的形成与再生、完整性的维持和功能的发挥中起重要作用5。本实验通过观察A-PRF、i-PRF 的超微结构，研究并对比 A-PRF、i-PRF 生长因子的释放量，各组基因 mRNA 的表达，以及 A-PRF、i-PRF 对 HGFs 增殖和 I 型胶原蛋白表达的影响，探究 A-PRF、i-PRF 对 HGFs 的作用机制，为临床血小板浓缩物的应用及选择提供更为科学的参考。材料和方法1.试剂和仪器L-DMEM 培养液（HyClone，中国）；鼠抗人波形蛋白抗体、鼠抗人角蛋白抗体（中杉金桥，中国）；ELISA 试剂盒（联科生物，中国）；CCK-8（大连美伦生物技术，中国）；逆转录试剂盒（TaKaRa，日本）；荧光定量 PCR 试剂盒（Bio-Rad，美国）；羊抗鼠 I 型胶原蛋白抗体（博奥森，中国）。2.A-PRF、i-PRF 以及条件培养基的制备采集 6 名志愿者（男女各 3 名）每人静脉血 10 ml，1500 r/min 离心 14 min，得到 A-PRF，介于顶端的少细胞浆液层与底端的红细胞层之间，700 r/min离心 3 min 得到 i-PRF，为最顶层的液体。将得到的A-PRF、i-PRF 分别放入 5 ml DMEM 培养液，7 天后吸出全部液体，离心去除红细胞，收集 5 ml 上清液配制成15%L-DMEM条件培养基。实验组用A-PRF、i-PRF 条件培养基，对照组用 15%L-DMEM 培养基。本实验通过伦理委员会批准（批号：2021-003）。3.A-PRF、i-PRF 超微结构观察A-PRF、i-PRF膜制备:用A-PRF工具盒将A-PRF压制成膜；i-PRF 为液体，吸出少量滴加到无菌盖玻片上，待其干燥后即可形成一层 i-PRF 膜6,7。显微结构:将 A-PRF 膜、i-PRF 膜置于 10%福尔马林溶液中固定 1 天；石蜡包埋，纵向切取厚度约 5 m 的切片，HE 染色，显微镜下观察并采集图像。超 微 结 构:将 A-PRF 膜、i-PRF 膜 放 入 3%戊二醛中浸泡，PBS 漂洗，1%锇酸 4 固定 2 h，PBS 漂洗，乙醇梯度脱水，乙酸戊二酯置换组织中的脱水剂 20 min，临界点干燥，固体 CO2置换其内的乙酸戊二酯 40 min，喷镀金属膜，扫描电镜下观察并采集图像。4.HGFs 原代培养及鉴定6HGFs 原代培养：牙龈来源于种植手术过程中环切的正常牙龈组织，患者知情同意。无菌条件下获取，PBS 冲洗,去除牙龈上皮,剪成 1 mm3 碎块,铺于 6 孔板底面,15%L-DMEM 培养基培养，37、5%CO2 及饱和湿度的环境下孵育。每2天换液1次，显微镜下观察组织块周围细胞生长情况，待细胞爬满板底 80%后传代。HGFs 鉴 定：细 胞 爬 片：取 第 3 代 细 胞，3104个/孔接种于放有无菌盖玻片的 6 孔板，孵育 1 天，PBS 冲洗，4%多聚甲醛固定。免疫化学染色：取固定好的细胞爬片，3%去离子 H2O2 孵育 10 min，PBS 冲洗；滴加 1.5%山羊血清封闭液，孵育 15 min；滴加以 1:200 比例稀释的鼠抗人波形蛋白及鼠抗人角蛋白抗体或 PBS（阴性对照），4 湿盒中孵育过夜；次日，室温复温30 min，PBS 冲洗；滴加生物素化羊抗鼠二抗，湿盒中孵育 15 min，PBS 冲洗；滴加辣根孵育 15 min，PBS 冲洗；DAB 避光显色，光镜下监视其显色，自来水冲洗终止显色；苏木素复染，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶