二氧化钛纳米管表面阿司匹林...构建及其对骨形成的影响研究_李芯彦.pdf

Chinese Journal of Practical Stomatology Mar.2023 Vol.16 No.2论著DOI：10.19538/j.kq.2023.02.013二氧化钛纳米管表面阿司匹林涂层的构建及其对骨形成的影响研究李芯彦，李毅，蔡东轩，宋文，张玉梅摘要：目的在二氧化钛纳米管（titania nanotubes，TNT）表面构建阿司匹林（acetylsalicylic acid，ASA）涂层，研究其对钛种植体骨结合的影响。方法阳极氧化法制备TNT阵列，使用含ASA的正电性壳聚糖（chitosan，CS）溶液和负电性DNA溶液在TNT表面进行层层自组装（layer-by-layer self-assembly，LBL），最终得到含ASA的聚合物涂层（TNT-ASA）组，其间使用接触角测量仪检测表面亲水性的变化。另设单纯TNT组和无ASA的聚合物涂层（TNT-CS）组作为对照。通过扫描电镜、原子力显微镜、X射线光电子能谱仪表征试样表面，使用紫外分光光度计测量试样表面ASA在磷酸盐缓冲液中的释放曲线。在试样表面培养MC3T3-E1细胞，采用CCK-8检测细胞活力，使用扫描电镜观察细胞形态。将试样植入SD大鼠股骨远端4周后，采用Micro-CT、HE染色和Masson染色评价试样骨结合效果。结果LBL过程中材料表面的接触角呈波浪形上下波动，最终于TNT表面制得的聚合物涂层厚度约400 nm。聚合物涂层加载 ASA 后 C 元素含量增加，O 元素含量降低，其负载的 ASA 可在 12 d 内缓慢释放。MC3T3-E1细胞在TNT、TNT-CS和TNT-ASA表面均增殖良好，呈多边形伸展；各组间细胞活力的差异无统计学意义（P 0.05）。Micro-CT结果显示，相较于TNT组、TNT-CS组，TNT-ASA组骨组织的骨体积分数更高（P 0.05）.Micro-CT results showed that the bone volume to total volume ofbone tissue in TNT-ASA group was higher than that in TNT group and TNT-CS group（P 0.05）.The results of HEstaining and Masson staining showed that there were more new bone formation around the implants in TNT-ASA group.ConclusionEffective loading of ASA on TNT surface can be achieved by LBL technology.The coating has the advantages of gradual drug release，no cytotoxicity and promoting bone formation.Keywords：titanium implant；titania nanotubes；acetylsalicylic acid；osseointegration195Chinese Journal of Practical Stomatology Mar.2023 Vol.16 No.2液，配制成质量分数为1%的CS溶液，充分混匀并37静置过夜，以此为LBL的聚阳离子溶液。在配制聚阳离子溶液时，额外向 CS 溶液中加入ASA，可获得含0.5 mmol/L ASA的CS溶液。单次配制聚阴离子和聚阳离子溶液的体积根据浸泡钛试样的数量决定。1.2.3聚合物涂层的构建及实验分组常温条件下，将具有TNT阵列的钛试样交替浸入带正电荷的CS溶液和带负电荷的DNA水溶液中，共7次循环，每次浸泡时间为10 min，更换浸泡液时使用去离子水漂洗试样表面，最终通过 LBL 技术在TNT表面制备聚合物涂层（TNT-CS）。另使用含ASA的CS溶液作为聚阳离子溶液在TNT表面进行 LBL，将所制得的聚合物涂层命名为 TNT-ASA。将上述构建得到不同聚合物涂层的钛试样分为TNT-CS组和TNT-ASA组；另设未构建任何聚合物涂层的仅具有 TNT 阵列的钛试样为 TNT组，作为对照。1.2.4材料学表征使用SEM观察试样表面聚合物涂层制备前后变化，接触角测量仪检测LBL期间试样表面亲水性变化，AFM测量试样表面粗糙度Sq值，XPS进行聚合物涂层的元素分析。每项实验中每组各使用钛片试样3枚。1.2.5ASA体外释放实验使用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）配制不同浓度的ASA标准液（0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mmol/L），使用紫外分光光度计检测溶液在波长275 nm处的光密度（OD）值，线性拟合出 ASA 浓度-OD 值的标准曲线。将TNT-ASA组钛片试样置于24孔板中，设置3 个平行孔，每孔加入 1 mL 的 PBS，37恒温孵育。每隔24 h吸取各试样的全部浸提液，并补充1 mL 新鲜 PBS 继续孵育。检测浸提液在波长275 nm处的OD值，直至无药物释放为止，绘制累积释放曲线。1.2.6细胞活力测定及形态观察将各组钛片试样置于24孔板中，每组设置3个平行孔，以2 104个/孔的密度接种MC3T3-E1细胞于试样表面，每孔加入1 mL含有10%胎牛血清、100 U/mL青/链霉素的-MEM培养基，置于含有5%CO2的37C恒温孵箱中培养，隔日换液。分别于细胞培养1、3、5 d后进行CCK-8检测，具体操作：去除原培养液，每孔加入 500 L 含 10%CCK-8 显色剂的-MEM培养液；37C孵育3 h后，收集100 L上述含 10%CCK-8 的培养液于 96 孔板中，检测波长450 nm处的OD值以评估细胞活力，同时将24孔板中的液体替换为1 mL新鲜-MEM培养液继续细胞培养。在第5天的CCK-8检测结束后，吸弃培养液并使用PBS漂洗3次，2.5%戊二醛4过夜固定细胞，使用30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脱水，每次10 min，使用六甲基二硅胺烷浸泡30 min后真空干燥，喷金后对试样表面细胞进行SEM观察。1.2.7动物体内植入模型的构建及骨结合测定本研究经空军军医大学第三附属医院动物伦理委员会批准 动物伦理审查号：No.2021 伦理字（kq-004）号。1.2.7.1分组及种植手术过程将18只清洁级雄性SD大鼠 4周龄，体重（100 15）g，饲养于空军军医大学第三附属医院动物饲养中心 随机分为3组，每组6只。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠，备皮，碘伏消毒术区；在双侧股骨远端做纵向皮肤切口，暴露股骨干骺端，制备1.6 mm 5.0 mm种植窝，分别将TNT组、TNT-CS组和TNT-ASA组钛棒试样植入种植窝内；分层缝合肌肉、筋膜和皮肤并再次消毒术区。1.2.7.2标本处理及检测常规饲养，术后4周处死大鼠，取材大鼠股骨远端种植区周围骨组织，4%多聚甲醛固定48 h后行Micro-CT检测，感兴趣区设定为以钛棒试样为中心、直径2 mm、长4 mm的圆柱形区域，计算各组的骨体积分数（bone volume to total volume，BV/TV）。Micro-CT检测完成后，使用EDTA（0.5 mol/L，pH 7.4）对骨组织进行4周的脱钙处理，之后小心去除钛棒试样，常规石蜡包埋、切片，行HE染色和Masson染色，光学显微镜下观察钛棒周围新生骨组织的情况。1.3统计学处理应用GraphPad Prism 8.0软件对数据进行统计学分析，正态分布的计量资料以“均数标准差”表示。两组间比较采用独立样本t检验；3组间总的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P 0.05为差异有统计学意义。196中国实用口腔科杂志 2023年 3月 第 16卷 第 2期TNT-CS组TNT-ASA组O元素含量（%）TNT-CS组TNT-ASA组C元素含量（%）相对强度（cps）结合能（eV）TNT-ASA相对强度（cps）结合能（eV）TNT-CSLBL层数水接触角（）abTNT组TNT-ASA组粗糙度Sq值（nm）TNT组TNT-ASA组ca AFM扫描钛片试样表面形貌；b钛片试样表面粗糙度（*组间比较，P 0.05）；c LBL过程中钛片试样水接触角检测结果（0为单纯TNT，奇数为含ASA的CS层，偶数为DNA层，LBL为层层自组装）图2钛片试样表面粗糙度和亲水性检测2结果2.1TNT-ASA的材料学表征2.1.1钛片试样表面形貌观察SEM结果显示，TNT表面呈现出均匀分布、孔径均一（约100 nm）的TNT阵列结构。当TNT表面经过7次LBL循环后，TNT形貌被均质、完整的聚合物涂层覆盖，该涂层厚度约为400 nm。见图1。2.1.2表面粗糙度和亲水性检测AFM检测结果显示，TNT-ASA 组试样表面的Sq值为（5.00 0.69）nm，显著低于TNT组 （23.20 0.62）nm，差异有统计学意义（t=26.570，P 0.05），说明TNT-ASA表面相较于TNT表面更为平滑（图2a b）。接触角测量结果显示，TNT 表面的水接触角为（4.47 0.29），首次沉积含ASA的CS涂层后，表面的水接触角升至（53.07 0.74），组装DNA涂层后水接触角降至（40.60 0.22），再次组装CS涂层后水接触角又回升至先前水平；此后水接触角基本在上述两个水平内与LBL过程形成协同波动（图2c）。2.1.3XPS检测钛片表面元素 对钛片试样表面进行XPS检测，相较于TNT-CS组，TNT-ASA组的C元素含量增加（t=4.039，P 0.05）、O元素含量降低（t=3.817，P 0.05），组间差异具有统计学意义（图3）。由于ASA分子比CS分子的C元素含量高、O元素含量低，故此结果可间接证明TNT-ASA钛片试样表面含有ASA。2.2ASA的体外释放实验ASA的标准曲线见图4a，拟合的线性回归方程为Y=1.210X-0.0318，R2=0.9936。TNT-ASA组钛片试样的ASA在PBS中的释放曲线见图4b。ASA的释放半衰期约为4.5 d，并最终在12 d后，其释放曲线趋于稳定。a TNT 表面观（10 000），其右上角为放大图（50 000）；b TNT 纵截面观（100 000）；c TNT-ASA 表面观（10 000）；d TNT-ASA纵截面观（50 000）图1SEM观察钛片试样表面及纵截面形貌ab TNT-CS组和TNT-ASA组钛片试样表面的XPS全谱分析；cd C元素和O元素定量分析；*组间比较，P 0.05图3钛片试样XPS表面元素分析abcdabcd197Chinese Journal of Practical Stomatology Mar.2023 Vol.16 No.2d细胞培养时间（d）OD值TNT组TNT-CS组TNT-ASA组abcac依次为TNT、TNT-CS、TNT-ASA组钛片试样表面的细胞黏附形态（SEM，2000）；d CCK-8检测各组钛片试样表面的细胞活力图5MC3T3-E1细胞在钛片试样表面的黏附形态和细胞活力TNT组TNT-CS组TNT-ASA组BV/TV（%）806040200abcdac 依次为TNT、TNT-CS、TNT-ASA组钛棒试样周围骨组织的Micro-CT三维重建图，黄色为与钛棒试样直接接触的骨组织；d 3组BV/TV比较；BV/TV为骨体积分数；*组间比较，P 0.05）。见图5d。2.4钛棒试样的体内骨结合分析2.4.1Micro-CT检测图6ac示Micro-CT三维重建图像，各组钛棒试样周围均能观察到与其直接接触的骨组织，其中TNT-ASA组钛棒周围骨组织较为连续、致密。定量分析结果显示，3组间总的比较，差异有统计学意义（F=11.200，P 0.05）；TNT-ASA 组的 BV/TV