单细胞转录组测序在药物成瘾研究中的应用_李琼.pdf

Reviews and Monographs综述与专论生物化学与生物物理进展Progress in Biochemistry and Biophysics2023，50（3）：单细胞转录组测序在药物成瘾研究中的应用*李琼1）王福艳2）张晓琴1）余志鹏1）唐梓航1）沈昊伟1，3）*（1）宁波大学医学院药理学系，宁波 315211；2）宁波大学医学院附属医院实验中心，宁波 315020；3）宁波康宁医院，宁波 315201）摘要 药物成瘾是复杂的中枢神经系统疾病，相关基础与临床研究均证实药物成瘾的神经机制及神经环路在成瘾行为形成的不同阶段逐渐发生改变。利用全基因组关联研究、全基因组测序、全外显子测序或高通量转录组测序等技术的组学研究对包括药物成瘾在内的精神疾病遗传的脆弱性进行了深入研究。上述单核苷酸多态性检测技术或测序技术主要预测疾病的遗传风险位点。然而，许多中枢神经系统疾病的发生与环境因素密切相关，而且在疾病发展的不同阶段，相关基因的表达存在脑区特异性的细胞异质性信息。因此，传统研究对发病机制的解释存在一定的局限性。单细胞转录组测序技术是针对单个细胞进行转录水平的测定，规避了传统测序对细胞群体平均转录水平检测的缺点，可以定量描述细胞异质性。近年来，单细胞转录测序技术在神经精神科学研究中的应用逐渐受到关注，本文总结了该技术在神经科学研究中的重要应用，并以药物成瘾为例，重点阐述说明其在中枢神经系统疾病中的应用价值。关键词 单细胞转录组测序，药物成瘾，神经科学中图分类号 R749，R446DOI：10.16476/j.pibb.2022.0121转录（transcription）是调控基因表达的关键步骤，具有可变性、适应性和动态性特征。转录动力学（transcription dynamics）是指在一定的时间跨度下，以分钟量级从对环境信号迅速反应到发育和疾病发生的缓慢变化1。2009年，汤富酬团队通过将改进的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术与高通量测序技术（high-throughput sequencing，HTS）2结合起来，实现了首次对单个细胞中的信使 RNA（message RNA，mRNA）进行完全无偏倚的转录组学研究，开创了单 细 胞 转 录 组 测 序（single-cell transcriptome sequencing，ScRNA-seq）3。ScRNA-seq通过直接测量数千到数百万个单个大脑细胞中的mRNA分子特征，可以全面地表征大脑细胞类型的多样性4。这种测量揭示了塑造细胞身份的基因调控机制，并提供了对细胞群体之间发展和进化关系的洞察5。现在，通过将ScRNA-seq细胞分类学数据和全基因组关联研究（genome wide association studies，GWAS）数据中提供的位点（loci）进行整合分析，可以发现大脑细胞类型和疾病性状的关联，能够更好地理解基因和精神类疾病的关系，推动精神类疾病机制和药物靶点研究6。药物成瘾是一种慢性的、复发性的大脑疾病，是神经科学重要的研究对象。药物成瘾不同阶段和状态涉及不同的神经环路及分子机制7。在成瘾形成的早期阶段，觅药行为以目的导向为主，依赖于行为-结果之间的关联，行为由正性结果（即奖赏）调控。在该阶段成瘾药物需求弹性指数较大。在第二阶段，随着反复用药，目的导向行为演变成为刺激-反应的过程。在这个阶段，药物所带来的奖赏并不像之前那样显著，觅药行为出现惯性特征，结果对行为的调控作用不显著。在第三阶段，长期使用成瘾药物的患者往往表现出强迫性觅药行为，具体表现为尽管面临严重的伤害性或惩罚性后果，成瘾者仍然无法控制自己的觅药及用药行为。与此同时，还表现出过强的目的导向行为和药物刚性需求。然而这些复杂行为的分子编码仍不为人所知，制约了对疾病机制的理解和有效的临床治疗策 国家自然科学基金（32171017）资助项目。通讯联系人。Tel：15988622731，E-mail：收稿日期：2022-03-30，接受日期：2022-06-24 498 2023；50（3）生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys.略的开发。本文主要介绍了ScRNA-seq在神经科学研究中的应用，并以药物成瘾为例，重点阐述其在精神疾病中的应用进展。1ScRNA-seq技术ScRNA-seq 是 利 用 下 一 代 测 序 技 术（next generation sequencing，NGS）、在单个细胞水平基于高通量测序进行完全无偏倚的细胞类型和状态研究的方法。自 2009 年来，许多灵敏、准确的ScRNA-seq 技术被开发出来，例如 Tang20093、CEL-seq28、Drop-seq9、MARS-seq10、Smart-seq211、Patch-seq12等，满足各类实验需求。本文对上述几种技术做了对比总结（表1）。2017 年，10Genomics 公 司 开 发 出 10Chromium13技术。该方法基于液滴的核酸条形码（barcode，BC）分配系统，对带有标签的互补脱氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA）进行PCR扩增、文库构建，以获得样本的单细胞基因表达数据。10Chromium可以在几分钟内封装成千上万个的单细胞，实现高通量的同时保持敏感性，具有快速细胞封装和较高细胞捕获率的优势（图1）。Table 1Comparison of ScRNA-seq methods表1ScRNA-seq方法对比方法Tang20093CEL-seq28Drop-seq9MARS-seq10Smart-seq211Patch-seq12扩增方法多聚腺嘌呤加尾法基于随机引物的体外转录法模板转换法体外转录法模板转换法模板转换法细胞分选方法微量移液管吸取微流控技术液滴分选技术荧光激活细胞分选技术荧光激活细胞分选技术膜片钳移液管抽吸细胞内容物通量高低高高低低局限性只能捕获有多聚腺嘌呤尾巴的信使RNA，距离mRNA的3端超过3 kb的5端将不会被检测到，不能区分正义和反义的转录本3只能用于3端测序，相较于全长转录组信息更少8细胞捕获率较低，不适于稀缺样本可出现3偏差，链特异性信息丢失10只能捕获有多聚腺嘌呤尾巴的信使RNA，不保留链或分子信息11捕获基因少Fig.1The general flow of scRNA-seq图1单细胞转录组测序大致流程李琼，等：单细胞转录组测序在药物成瘾研究中的应用2023；50（3）499 每个神经元的形态、连接性和电生理特性方面都不相同，运用ScRNA-seq技术剖析神经元细胞异质性，在细胞水平分辨率提供特定解剖部位中神经元细胞不同类型、不同状态的基因表达信息，对神经细胞进行无偏倚的分类14。然而由于神经细胞的特殊结构，如不规则的细胞体、神经元细胞轴突发达、整体细胞直径较大，导致RNA捕获率低、上机起始材料低，获得的数据有一定程度的丢失，实验方案具有挑战性。Regev 团队15开发出 Div-Seq，一种对神经元细胞进行抽提细胞核，将获得的单个细胞核进行测序，又称单核RNA测序（single-nucleus RNA-seq，SnRNA-seq）。这项技术对于神经元细胞特殊性做了补充，可以满足大脑组织难解离以及冷冻组织的需求。ScRNA-seq通过对单个细胞中多种标记物的定量分析，解析大脑细胞分子基因特征。一种常见的方法是分析单个细胞中多个基因的表达，然后基于基因共表达模式，通过聚类将细胞分成组。Yao等16联合分析了7个ScRNA-seq和SnRNA-seq数据 集，将 小 鼠 初 级 运 动 皮 层（primary motor cortex，MOp）的细胞划分为 59 种-氨基丁酸能（GABAergic）抑制性神经元、31种谷氨酸能兴奋性神经元和26种非神经元，建立了Mop的细胞转录图谱。研究对成年小鼠MOp的细胞类型多样性进行了全面的分类和注释，基于转录特征对单个细胞类型进行靶向研究，使设计针对小鼠MOp中特定细胞类型在神经回路和行为中的功能分析成为可能。Zeisel等17使用系统的ScRNA-seq来测序小鼠横跨整个中枢神经系统（central nervous system，CNS）和外周神经系统（peripheral nervous system，PNS）的细胞，利用获得的所有细胞类型基因表达数据，讨论哺乳动物神经系统的总体结构，构建了其细胞转录图谱。大脑细胞的异质性给神经科学的研究带来了较大困难，极大地限制了人们对于精神类疾病的机制和药物靶点的研究。ScRNA-seq对于细胞和细胞亚型精确细致的分类14，使人们对于大脑细胞异质性的认识达到一个前所未有的分辨率，解析大脑细胞异质性对于神经科学的研究是至关重要的。以上研究揭示了小鼠神经系统的分子特征，提供了更清晰的神经系统细胞多样性图谱，为哺乳动物神经系统提供了参考图谱。该图谱可用于基因靶向细胞的化学遗传、光遗传、基因靶向调控等操作，并为了解特定基因的功能提供帮助。2ScRNA-seq在药物成瘾机制研究的应用2.1药物成瘾精神病学研究中动物模型对临床情况的转化价值是评判该模型的最佳标准，临床试验的失败通常被归因于临床前动物模型的预测能力有限。基于精 神 障 碍 诊 断 和 统 计 手 册（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，DSM-5）18构 建 的 操 作 性 条 件 的 自 我 给 药（self-administration）成瘾模型，被广泛应用于临床前成瘾研究，该模型涵盖了药物成瘾全过程：a.形成，偶然用药、规律用药和强迫用药；b.戒断和消退；c.线索、药物或应激诱导的复吸。该模型较好地满足了动物模型的表观效度、结构效度和预测效度19。此外，被动给药方式也用于观察药物对机体及行为的直接药理学影响，对于自我给药和被动给药引起的基因表达差异性尚需进一步研究。慢性暴露于成瘾药物会诱导大脑奖赏区域的的分子适应性变化，从而导致行为的持久改变。通过关注药物成瘾相关大脑奖赏区域的分子基础，可确定治疗成瘾障碍的新靶点20。既往研究中已发现，一些关键的分子靶点能改变模型动物的成瘾行为。例如，N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA受体）2B亚基拮抗剂通过调节皮质-边缘系统投射的可塑性、内源性大麻素模拟药通过促进星型胶质细胞谷氨酸释放可有效抑制可卡因成瘾动物的复吸行为21-22；而具有拮抗5-羟色胺（5-HT）3受体和激动7尼古丁受体的复合作用的托烷司琼可减少可卡因成瘾动物的的强迫觅药行为23。然而，迄今为止，药物成瘾领域的基础研究在临床上成功转化应用的例数甚少。其中一个原因是，过去对药物成瘾模型的研究大都关注特定的分子或信号通道。可是，药物成瘾涉及认知、情感、本能等方面，单个分子改变难以解释这种极为复杂的行为模式。而且，如果缺少神经细胞类型特异性信息，药物成瘾精确的分子机制难以充分阐明。因此，ScRNA-seq在药物成瘾研究领域的应用有望为上述问题的解决带来曙光。2.2解析药物成瘾相关神经环路中关键脑区的细胞异质性成瘾药物的奖赏作用主要依赖于伏隔核（nucleus accumben，NAc）中的多巴胺信号。成瘾药物反复使用导致的动机强化涉及更为广泛的神经环路，其中皮质中脑边缘系统、皮质-纹状体-丘脑-500 2023；50（3）生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys.皮质环路以及海马（hippocampus，HA）的功能改变最为引人关注24。Ho等25应用ScRNA-seq对小鼠背内侧纹状体（dorsomedial striatum）的中型多棘神经元（medium spiny neurons，MSNs）进行检测，通过确认已建立的标记基因多巴胺1受体（dopamine 1 receptor，D1R）和多巴胺 2 受体（dopamine 2 receptor，D2R