大豆皂苷缓解骨关节炎模型大鼠软骨损伤和关节炎症的机制_张超.pdf

免疫学杂志2023年3月第39卷第3期IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.39No.3 Mar.2023 论著 文章编号1000-8861（2023）03-0225-08；DOI10.13431/ki.immunol.j.20230029大豆皂苷缓解骨关节炎模型大鼠软骨损伤和关节炎症的机制张超，张锐，王冶，彭玲*，蒋萍摘要 目的 探究大豆皂苷缓解骨关节炎模型大鼠软骨损伤和关节炎症的可能机制。方法 SD大鼠随机分为假手术组、模型组、大豆皂苷低剂量组（20 mgkg-1）、大豆皂苷中剂量组（40 mgkg-1）、大豆皂苷高剂量组（80 mgkg-1）和双醋瑞因组（54mgkg-1），每组15只；切断前交叉韧带的方式构建骨性关节炎模型。HE和番红氧固绿染色观察关节滑膜组织病理损伤并进行Mankins评分和OARSI评分，酶联免疫吸附测定（ELISA）检测肿瘤坏死因子-（TNF-）、白细胞介素-1（IL-1）、IL-6水平，Western blot检测丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）、转录因子核因子B（NF-B）、NOD样受体家族蛋白3（NLRP3）、凋亡相关微粒蛋白（ASC）、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）蛋白表达。结果 与模型组比较，大豆皂苷（中、高）剂量组和双醋瑞因组大鼠软骨组织表面较光滑，Mankins、OARSI评分降低，血清及关节液中TNF-、IL-1、IL-6水平降低，p-p38 MAPK/p38MAPK、p-NF-B p65/NF-B p65、NLRP3、ASC、Caspase-1表达降低（P0.05），且具有剂量效应（P0.05）。结论 大豆皂苷可缓解骨关节炎大鼠软骨组织损伤及关节炎症损伤，其机制可能与抑制MAPK/NF-B信号通路和NLRP3炎症小体活化有关。关键词 骨关节炎；大豆皂苷；软骨损伤；丝裂原激活的蛋白激酶；转录因子核因子B中图分类号 R684.3文献标识码 ASoyasaponins alleviate cartilage damage and joint inflammation ofosteoarthritis ratsZHANG Chao1,ZHANG Rui1,WANG Ye1,PENG Ling2,*,JIANG Pin11.Department of Orthopedics,Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College,Nanchong 637002,China;2.Department of Clinical Nutrition,Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College,Nanchong 637002,China*Corresponding Author:PENG Ling,E-mail:Abstract This study was performed to explore the possible mechanism of soyasaponins alleviating cartilagedamage and joint inflammation in osteoarthritis rats.In the experiment,SD rats were recruited and randomly dividedinto sham operation group,model group,low-dose,medium-dose and high-dose soyasaponins groups(20,40,80mgkg-1),and diacerein group(54 mgkg-1),with 15 rats in each group.The osteoarthritis model was constructed byresection of anterior cruciate ligament.The pathological damage of synovial tissues was observed by HE and safraninfast green staining;Mankins scoring and OARSI scoring were conducted;the levels of tumor necrosis factor-(TNF-),interleukin-1(IL-1)and IL-6 were detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Western blot was used to detect the expressions of mitogen-activated protein kinase(MAPK),nuclear factor B(NF-B),nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors 3(NLRP3),apoptosis-related microparticle protein(ASC)and cysteine aspartate protease-1(Caspase-1).Data showed that compared with model group,medium-doseand high-dose soyasaponins groups and diacerein group demonstrated smoother surface of cartilage tissues,lowerlevels of Mankins and OARSI scores,lower levels of TNF-,IL-1 and IL-6 in serum and joint fluid,lowerexpression of p-p38 MAPK/p38 MAPK,p-NF-B p65/NF-B p65,NLRP3,ASC and Caspase-1(P0.05),andthere was dose effects(P0.05).In conclusion,soyasaponins can alleviate cartilage tissue damage and jointinflammation damage in osteoarthritis rats,which may be related to inhibiting MAPK/NF-B signaling pathways andNLRP3 inflammasome activation.KeywordsOsteoarthritis;Soyasaponins;Cartilage damage;Mitogen-activated protein kinase;Nuclear factor kappa B基金项目：南充市科技项目（18SXHZ0341）作者单位：637002 南充，川北医学院附属医院骨外科（张 超，张 锐，王 冶，蒋 萍），临床营养科（彭 玲）*通信作者：彭 玲，E-mail：225免疫学杂志2023年3月第39卷第3期IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.39No.3 Mar.2023骨关节炎是常见的慢性关节退行性疾病，随着我国人口老年化进程其发病率不断升高，由于缺乏特效疗法，该病已成为老年群体的第 4 大致残因素1。骨关节炎的发病机制较为复杂，与炎症、关节液丢失、细胞因子和代谢异常等因素有关。关节软骨组织凋亡和基质降解是引发膝骨关节炎软骨退变的主要病理因素2。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是参与机体炎症反应、细胞增殖、凋亡等诸多病理、生理过程重要信号通路的关键蛋白3，骨关节炎患者软骨组织中MAPK磷酸化水平明显高于正常组织且其表达水平与骨关节炎的炎症程度呈正相关4。转录因子核因子B（nuclear factor-B，NF-B）蛋白是在真核细胞中广泛表达转录因子家族重要成员之一，在免疫应答及炎症反应中发挥重要作用5。动物试验发现II型胶原诱导、药物诱导的关节炎模型滑膜组织NF-B表达升高，且NF-B与基质金属蛋白酶偶联可介导进展性细胞外基质损伤和关节软骨降解6。NOD样受体 家 族 蛋 白 3（nucleotide-binding oligomerizationdomain-like receptors 3，NLRP3）作为 NLRs 家族中研究最为透彻的成员，被证实是多种退化性疾病研究的关键分子，其形成的炎性小体可促进炎性细胞因子、降解酶表达，诱导软骨退化和滑膜炎症7。大豆皂苷来源较广，可在多种植物中广泛分布，其生物活性多样且毒副作用低，为五环三萜齐墩果酸型低糖化合物，具有降血脂、防止动脉粥样硬化、拮抗炎症、抗肿瘤等作用8。本研究观察大豆皂苷对骨关节炎模型大鼠软骨损伤、关节炎症以及软骨组织MAPK/NF-B信号通路和NLRP3炎症小体的影响，为缓解骨关节炎软骨损伤和关节炎症提供实验依据。1材料与方法1.1实验动物90只清洁级4周龄SD大鼠，雌雄各半，体质量100120 g，购于川北医学院，许可证号：SCXK(川)2018-18。所有SD大鼠均饲养于培育室，温度2025，湿度保持在65%70%，人工光照（12 h/昼、12 h/夜），全天自由饮水。实验过程对动物的所有处置方式均参照中国科学技术部发布的指导性意见执行9。1.2主要试剂及仪器大豆皂苷（成都普瑞法科技开发有限公司，纯度90.3%，批号：205024）；双醋瑞因（昆明积大制药股份有限公司，批号：201024A）；HE染色试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司，批号：1912031）；番红氧、TRAP试剂盒（美国Sigma公司，批号：200112、200318）；肿瘤坏死因子-（tumor necrosis factor-，TNF-）、白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、IL-6检测试剂盒（上海吉泰依科赛生物科技有限公司，批号：191024、191126、191118）；兔抗大鼠 p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-B p65、p-NF-B p65、NLRP3、凋亡相关微粒蛋白（apoptosis-associated microproteins，ASC）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）抗体（美国Thermo Fisher公司，批号分别为：200427、201019、200618、201127、191027、190926、190717、191210）。显微镜（日本Olympus公司，DP11）；凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad 公司，ChemiDoc MP）；酶标仪（美国 Thermo 公司，Multuskan Go 1510）。1.3动物模型制备、分组及处理将90只SD大鼠随机数表法分为假手术组，模型组，大豆皂苷低剂量组、中剂量组、高剂量组和双醋瑞因组（作为阳性对照），每组15只。参考文献方法10制备骨性关节炎模型，正常饮食管理后，右肢踝骨处出现不同程度的歪曲和颤动，表示造模成功。造模完成后，大豆皂苷低剂量组（20 mgkg-1）、中剂量组（40 mgkg-1）、高剂量组（80 mgkg-1）组大鼠分别给予大豆皂苷20、40、80 mgkg-1灌胃，双醋瑞因组大鼠给予54 mgkg-1双醋瑞因灌胃11，假手术组及模型组给予等量生理盐水灌胃，每日1次，共持续4周。1.4样品采集与处理末次处理后，各组随机数表法选取8只大鼠，戊巴比妥钠麻醉后，向处理关节腔内注射100 l 10%生理盐水后被动屈伸关节30次，抽取关节液50 l，将关节液1 000g离心