氮和磷共掺杂碳纳米粒子荧光猝灭选择性检测亚叶酸钙_李莉.pdf

第 51 卷分析化学（FENXI HUAXUE）研究报告第 2 期2023 年 2 月Chinese Journal of Analytical Chemistry296304DOI:10.19756/j.issn.0253-3820.221407氮和磷共掺杂碳纳米粒子荧光猝灭选择性检测亚叶酸钙李莉*#1李猛#2杨明利1李洪雷1张焕1马跃1林乐儿1张明*11（南京医科大学康达学院，连云港 222000）2（连云港市第二人民医院胸外科，连云港 222000）摘要以磷酸铵（NH4）3PO4）和抗坏血酸钠为原料，通过一步水热法合成了氮和磷共掺杂碳纳米粒子（N/P-CNPs），量子产率为19%。基于亚叶酸钙（CF）对N/P-CNPs的快速、高选择性猝灭，建立了测定CF的新方法。在最优实验条件下，在0.2108.5 mol/L范围内，CF的浓度与N/P-CNPs的荧光猝灭程度（F0 F）/F0，F0为N/P-CNPs的初始荧光强度，F为加入 CF 后的荧光强度）呈良好的线性关系，检出限为0.05 mol/L。经实验验证，CF对N/P-CNPs的荧光猝灭机理为内滤效应和静态猝灭效应。将本方法用于实际样品中CF含量的检测，所得结果与高效液相色谱法测定结果基本一致，表明本方法具有良好的实用性，为检测CF提供了一种新策略。关键词 氮和磷共掺杂；碳纳米粒子；荧光；亚叶酸钙；内滤效应；静态猝灭亚叶酸钙（Calcium folinate，CF）是抗肿瘤药物的生化调节剂，可直接提供叶酸在体内的活化形式，有利于胸腺嘧啶核苷酸、DNA、RNA 以及蛋白质的合成。CF 可限制甲氨蝶呤对正常细胞的损害程度，并能逆转甲氨蝶呤对骨髓和胃肠粘膜反应，临床上主要用作叶酸拮抗剂（如甲氨蝶呤、乙胺嘧啶或甲氧苄啶等）的解毒剂，能预防甲氨蝶呤过量或大剂量治疗后所引起的严重毒性作用1，也可用于叶酸缺乏所引起的巨幼红细胞性贫血的治疗。CF 与 5-氟脲嘧啶合用，可用于治疗晚期胰腺癌2-3、结肠和直肠癌4-8。CF 注射液因具有疗效显著、作用迅速、毒性小、耐受性好以及副作用低等优点而在临床上应用广泛。随着临床用药量的大幅增加，对 CF 产品质量要求也有所提高，对 CF 含量测定方法的要求更准确、更精密。因此，开发准确定量检测 CF 含量的方法非常必要。目前，检测 CF 的方法有高效液相色谱法、毛细管电泳法和电化学法等9-15。荧光检测法具有原位、实时和无损检测目标分子等优点，已成为疾病诊断、环境和食品安全监测领域不可或缺的工具16。其中，碳纳米材料可应用于荧光传感领域检测多种分析物17-19，成为近年来的研究热点。在早期的研究中，制备的碳纳米材料的荧光量子产率较低，并且荧光较弱。向碳纳米材料中掺入其它杂原子（如N、S和P等）或金属元素，可以显著改善其光学性能，提高荧光量子产率20-23。目前，有关氮和磷共掺杂碳纳米材料的研究虽已有报道20，24，但尚未将氮和磷共掺杂碳纳米材料用于实际样品中CF的测定。本研究以廉价易得的磷酸铵（NH4）3PO4）和抗坏血酸钠为原料，通过水热法合成了对 CF 具有选择性荧光响应的氮和磷共掺杂碳纳米粒子（Nitrogen and phosphorus codoped carbon nanoparticles，N/P-CNPs），探讨了其结构组成和荧光性能，并基于 CF 对 N/P-CNPs 的荧光猝灭作用，建立了定量检测 CF 的新方法。1实验部分1.1仪器与试剂RF-6000 荧光分光光度计、AUW220D 电子天平和 AYT124 电子天平（日本岛津公司）；Milli-Q 超纯2022-08-09 收稿;2022-12-11 接受江苏省高校优秀中青年教师和校长境外研修计划基金项目、江苏高校“青蓝工程”项目(No.KD2021qljs001)、连云港高新区科技计划项目(No.HZ201906)、连云港市“海燕计划”项目(No.2020-QD-005)、江苏省大学生创新创业训练计划项目(Nos.202113980012Y,202113980014Y)和南京医科大学康达学院科研发展基金项目(Nos.KD2020KYJJZD074,KD2021KYJJZD014,KD2021KYRC003,KD2021KYRC015)资助。#共同第一作者*E-mail:;水机（美国密理博公司）；DHG-9070A 电热鼓风干燥箱（上海精宏实验设备公司）；BioMate 3S 紫外-可见分光光度计、Nicolet iS50 傅里叶变换红外光谱仪、Heraeus Multifuge X1R 台式冷冻离心机（美国赛默飞世尔科技公司）；C-MAG HS7 磁力加热搅拌器（德国 IKA 公司）；HT7800 高反差型透射电子显微镜（日本日立公司）；FLS1000 稳态瞬态荧光光谱仪（英国爱丁堡公司）；SHZ-DIII 循环水真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；LC-10N-50C 真空冷冻干燥机（上海力辰邦西仪器科技有限公司）；XH-C 涡旋混合器（金坛市白塔新宝仪器厂）。（NH4）3PO4、Na2S2O3、Na2CO3、MgSO4、KCl、MnCl2、CaCl2、NaNO2、Na2HPO412H2O、KH2PO4、1,2-丙二醇、无水葡萄糖（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；抗坏血酸钠、甘氨酸、半胱氨酸、乙酸锌二水合物（分析纯，萨恩化学技术（上海）有限公司）；NaCl（分析纯，南京化学试剂股份有限公司）；甲硫氨酸（分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；还原型谷胱甘肽（分析纯，上海麦克林生化科技有限公司）；CF 对照品（含量为 87.9%，中国食品药品检定研究院）；CF 注射液（规格：10 mL；0.1 g，按 C20H23N7O7计，江苏恒瑞医药股份有限公司）；唑来膦酸一水合物对照品（按 C5H10N2O7P2计，含量为92.7%）、多西他赛对照品（按 C43H53NO14计，含量为 99.2%）、奥沙利铂对照品（按 C8H14N2O4Pt 计，含量为 99.8%）（中国食品药品检定研究院）。实验用水为超纯水（18.2 Mcm）。1.2实验方法1.2.1N/P-CNPs的合成准确称取 0.8 g 抗坏血酸钠和 7.2 g（NH4）3PO4，加入 48 mL 超纯水，搅拌溶解。将混合溶液转移至聚四氟乙烯内衬水热反应釜中，于 160 下恒温加热 13 h，反应完成后自然冷却至室温。将所得褐色溶液以 12000 r/min 离心 5 min 后，上清液用 0.22 m 水系滤膜过滤，然后用截留分子量为 3500 Da的透析袋透析上清液 48 h，得到水溶性 N/P-CNPs。采用旋转蒸发仪蒸去大部分溶剂水，再冷冻干燥 48 h 得到褐色粉末，于 4 下储存备用。1.2.2溶液的配制CF 对照品溶液的配制准确称取 CF 对照品 10.81 mg，用超纯水溶解并定容至 10 mL，得到 CF 对照品储备液（1579 mol/L），然后再将其逐级稀释成不同浓度的 CF 对照品溶液，4 下保存备用。CF 供试品溶液的配制准确量取 CF 注射液 250 L 于 100 mL 容量瓶中，用超纯水定容，得到标示浓度为 52.9 mol/L 的 CF 供试品溶液。N/P-CNPs 溶液的配制准确称取 N/P-CNPs 5 mg，加入 5 mL 超纯水，涡旋混合使之溶解，得到浓度为 1 mg/mL 的 N/P-CNPs 的溶液。10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS）的配制称取8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4，用800 mL 超纯水溶解后，用 HCl 或 NaOH 溶液调节至 pH 4.010.0，最后加超纯水定容至 1 L。1.2.3CF的检测为测试 N/P-CNPs 对 CF 的荧光响应，取 100 L N/P-CNPs 溶液、1500 L 不同浓度的 CF 对照品溶液和 400 L 10 mmol/L PBS（pH=6.86），充分混合后，将样品置于荧光分光光度计的样品池中。以 308 nm为激发波长，测试上述系列溶液的荧光光谱，记录 438 nm 处的荧光强度。测定实际样品时，用相同体积的 CF 供试品溶液替换 CF 对照品溶液，在同样的条件下进行检测。1.2.4N/P-CNPs的荧光量子产率测定采用比较测量法进行测试，以 QE=54%的硫酸奎宁作为标准物，分别测量硫酸奎宁和 N/P-CNPs 的发射光谱（ex=350 nm）及紫外-可见吸收光谱，采用公式（1）计算量子产率。IxIstxstAstAxQE=QE 1xst22其中，x 代表样品，st 代表标准物硫酸奎宁，QEx和 QEst分别为待测物质和参比标准物质的荧光量子产率；I 为荧光发射光谱的积分强度，为溶剂折射率（因本实验中待测未知物和参比标准物的浓度极低，可忽略溶质的影响，而视为一致，均为 1.33），A 为 350 nm 处的吸光度。第 2 期李莉等：氮和磷共掺杂碳纳米粒子荧光猝灭选择性检测亚叶酸钙2972结果与讨论2.1N/P-CNPs的表征通过透射电镜（TEM）观察 N/P-CNPs 的形貌特征和粒径尺寸。图 1 是 N/P-CNPs 的 TEM 表征图，插图为其粒径分布图，可见 N/P-CNPs 的形貌近似呈球状，并且分散性良好，平均粒径约为 97 nm。图 2A 是 N/P-CNPs 的红外光谱图，其中，3421 和3247 cm1处的宽峰可归属于OH 和NH 的伸缩振动，2927 cm1归属于CH的伸缩振动，1629 cm1处的吸收峰归属于 CO 伸缩振动，1400 cm1处的吸收峰归属于 CH的面内弯曲振动，在指纹区 1075 cm1处的吸收峰归属于 PCO 伸缩振动，945 cm1处的吸收峰表明存在POH，523 cm1处的吸收峰表明存在 PO43 20，24。通过 XPS 表征分析 N/P-CNPs 的元素构成，如图 2B所示，在总谱图上出现了 4 个峰，分别对应磷、碳、氮和氧元素，结合能分别为 133.3、284.3、399.3 和531.3 eV。结合能为 284.3 eV 的 C1s 峰（图 2C）可分为3 个峰，对应的结合能分别为 284.4、285.0 和 287.5 eV，表明 N/P-CNPs 表面有 CC/C=C、CN/CP和 C=O 基团的存在。如图 2D 所示，对结合能为 399.3 eV 的 N1s 峰进行分峰解析，结合能分别为398.7、399.4 和 400.6 eV 的峰分别对应 CNC、CN 和 NH 基团。结合能为 531.3 eV 的 O1s 峰（图 2E）可分为 3 个峰，对应的结合能分别为 530.6、532.0 和 535.5 eV，证明了 O=P/OP、OC/OP和OH 基团的存在。图 2F 的 P2p 分峰后，132.9 和 133.5 eV 的结合能分别归因于 PC 和 P=O/PO基团。上述表征结果说明，成功合成了表面具有羟基、氨基、羧基及磷酸基团的 N/P-CNPs。70809010011005101520253035Fraction/%Size/nm200nm图1氮和磷共掺杂碳纳米粒子(N/P-CNPs)的透射电镜图，插图为 N/P-CNPs 的粒径分布Fig.1Transmission electron microscope(TEM)imge of nitrogen and phosphorus codoped carbonnanoparticles(N/P-CNPs).Inset is particle sizedistribution of N/P-CNPsFEDCB342132472927162914001075523945O 1sN 1sC 1sP 2pP=OP-OC-CC=CC=OAN-CC-N-CN-HOHO-CO-PO=CO=PP-CBinding energy/eVBinding energy/eVIntensity/a.u.Intensity/a.u.Inte