复合性状转cry2A-__...1、F_2、F_3的适合度_李雷.pdf

南京农业大学学报，（）：收稿日期：基金项目：海南省重大科技计划项目（）；国家转基因生物新品种培育重大专项（）作者简介：李雷，硕士研究生。通信作者：宋小玲，教授，研究方向为转基因作物生态安全评估，：。李雷，肖乐铨，王园园，等 复合性状转 基因水稻 与杂草稻、的适合度 南京农业大学学报，（）：，（）：复合性状转 基因水稻 与杂草稻、的适合度李雷，肖乐铨，王园园，强胜，戴伟民，宋小玲（南京农业大学生命科学学院，江苏 南京）摘要：目目的的 本文旨在评价复合性状转 基因水稻 向杂草稻基因漂移的生态风险。方方法法 在农田非竞争环境下，以、受体水稻明恢 及其分别与江苏泰州（）、广东茂名（）、湖南益阳（）杂草稻的杂交后代（以 为父本的抗性后代、，以 为父本的非抗性后代、）为材料，评价 与杂草稻杂交后代的适合度。结结果果 抗性基因在杂交后代中的传递符合孟德尔遗传规律；外源抗虫基因的导入显著降低抗性杂交后代的靶标虫压。虽然抗性杂交后代与相应非抗性杂交后代的部分适合度指标存在差异，但总相对适合度均无显著差异；抗性杂交后代总相对适合度显著高于或相当于相应杂草稻，且随杂交代数的增加无显著变化。抗性杂交后代与相应非抗性杂交后代的落粒率均无显著差异，除、与 相当外，其他杂交后代的落粒率均显著低于相应杂草稻。和 在 和 埋藏 后，只有 的 和 种子具有活力。结结论论 在低虫压下，、的抗性杂交后代与杂草稻相比尽管具有相似或较高的营养和生殖能力，但落粒性和种子越冬能力较低，而 的抗性杂交后代种子虽然具有越冬能力，但落粒率较低，且从三代抗性杂交后代适合度变化来看，并无适合度提高的风险。因此在无除草剂选择压下 向杂草稻基因漂移可能引起的生态风险较低。关键词：复合性状转基因水稻；杂草化；杂交后代；适合度；杂草稻基因型中图分类号：文献标志码：文章编号：（），（，）：，（）（），（）（）（），（）（），第 期李雷，等：复合性状转 基因水稻 与杂草稻、的适合度 ，：；全球转基因作物种植面积从 年的 万 增加到 年的 亿，涉及 多种作物，包括抗除草剂和抗虫等多种单一性状以及复合性状。由于种植转基因抗除草剂和抗虫复合性状作物能提高对杂草和靶标害虫的防除效果，提高作物产量，近年来该复合性状研究发展迅速。我国多家机构已经培育出多个具有商业化前景的抗除草剂和抗虫复合性状转基因水稻，为安全释放这些水稻，需充分了解其潜在的杂草化生态风险。转基因水稻杂草化风险主要包括：）转基因水稻的自身杂草化；）抗性基因通过花粉漂移到近缘杂草中，产生携带抗性基因的杂交后代。已有的报道普遍认为转基因抗除草剂或抗虫水稻由于竞争能力、繁育能力、落粒性、休眠性和种子活力保存能力等特性与受体水稻无显著差异，因而自身杂草化风险低。转基因水稻的抗性基因通过花粉漂移到同属同种的杂草稻（）中最值得关注，。杂草稻具有极强的杂草特性，表现为落粒性、休眠性、抗逆性及竞争能力强，并且由于开花早、灌浆期短、胚乳成熟快等早熟特性，能逃脱人工收获，进入土壤种子库，形成来年继续危害的种子来源。杂草稻与栽培稻的亲缘关系近，亲和性极高，极易杂交。大量研究证实转基因水稻的抗性基因能通过花粉漂移至杂草稻，漂移率为，这意味着种植转基因抗除草剂和抗虫水稻后抗性基因可通过花粉漂移产生抗性。因此，应重点关注 及其后代的适合度，这是判断转基因水稻抗性基因向杂草稻漂移后对农业生产和生态环境是否产生潜在危害的重要依据。在转基因抗除草剂水稻与杂草稻杂交后代适合度的研究中，大多数研究表明，在无除草剂选择压下，较杂草稻亲本在株高、分蘖等方面表现出适合度优势，但繁殖能力较低，而 与相应杂草稻亲本结实率相似或低于杂草稻。转基因抗除草剂水稻与杂草稻杂交后代的适合度特别是繁殖能力与亲本亚种类型有关，亚种内杂交后代与杂草稻亲本具有相似的结实率，而亚种间杂交后代结实率低于杂草稻亲本，。转基因抗虫水稻与杂草稻杂交后代的适合度表现与虫压环境密切相关，通常携带抗性基因的杂交后代在高虫压下表现出适合度优势，在低虫压或无虫压下与不含抗性基因的杂交后代以及杂草稻适合度相似或表现适合度代价。因此，转基因水稻和杂草稻杂交后代的适合度受亲本基因型及环境条件特别是选择压的影响。目前对于复合性状转基因水稻研究报道很少。等报道了复合性状转 基因水稻 与 种杂草稻的杂交 代（）的适合度，结果表明，与相应受体水稻的杂交 代（）和杂草稻相比，在自然虫压单种下，表现出明显适合度优势或与 和杂草稻相似；在无虫压单种条件下，的适合度显著低于 或与 无显著差异。在混种自然虫压或无虫压条件下，与各自杂草稻相比，表现出明显的适合度优势或与杂草稻相似。无论有无虫压，在单种喷施草铵膦与喷施常规除草剂选择压下的适合度相似。复合性状转 基因水稻 由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室培育。田间试验结果表明，遗传稳定，对二化螟、三化螟和稻纵卷叶螟表现出高度的抗性，同时具有很好的抗草铵膦特性，农艺性状与受体明恢 基本一致，具有产业化前景。前期研究发现 的自身杂草化的风险较低，但在田间 向供试江苏泰州和湖南益阳杂草稻均能发生基因漂移，漂移率为 。本研究以复合性状转 基因水稻 及其受体水稻明恢 与 种杂草稻的、和 为供试材料，研究其在自然虫压单种条件下的适合度，评价 与杂草稻发生基因漂移后可能存在的生态风险，同时也为制定复合性状转基因水稻风险评价标准提供试验依据。材料与方法 试验材料复合性状转基因水稻 是由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室采用共转化的方式获得将人工改造合成的抗虫基因 与选择标记基因抗草铵膦 连接，转化恢复系明恢 南 京 农 业 大 学 学 报第 卷（）。种杂草稻广东茂名（）、江苏泰州（）和湖南益阳（）由南京农业大学杂草研究室试验人员采集（表）。及 与 种杂草稻的 均由本实验室杂交获得，和 分别由和 自交所得。以 为父本、杂草稻为母本获得的、（携带抗性基因）用、表示；以 为父本、杂草稻为母本获得的、（未携带抗性基因）用、表示（表）。表 试验材料来源和主要特征 试验材料 代号 籼粳型 果皮颜色 复合性状转基因水稻 籼型 白色 明恢 籼型 白色 广东茂名杂草稻 ，籼型 红色 江苏泰州杂草稻 ，偏籼型 红色 湖南益阳杂草稻 ，籼型 红色 表 水稻和杂草稻的杂交后代 类型 杂交方式（）表示形式（）（）（）（）（）（）试验设计试验在南京农业大学牌楼试验基地（，）进行。按照常规稻田的标准对整个生长期水稻进行水肥和病虫害管理。试验完成后所有剩余材料全部烧毁。在试验田四周种植玉米，符合国家相关规定。育秧 年 月 日，以 及其亲本为供试材料，每种供试材料选取约 粒，均匀撒播于 的小区。年 月 日及 年 月 日，分别以、及其亲本为供试材料，每个材料 粒，均匀撒播于 的小区。杂交后代鉴定及、抗性基因遗传规律分析 鉴定方法参考 等的方法，以 为父本的抗性杂交后代鉴定：以 为父本、杂草稻为母本的、秧苗生长至 叶期时喷施 草铵膦可溶液剂（拜耳股份公司），有效成分用量 ，经过预备试验筛选得知该剂量能有效区分携带抗性基因的植株和不携带抗性基因的植株。采用 手持式喷雾器（中国市下控股有限公司）均匀喷雾，喷雾压力约为 ，周后仍正常生长的秧苗认为是携带抗性基因的植株，枯黄秧苗则认为不携带抗性基因。待存活幼苗生长到 叶期，选取存活植株叶片进行 基因及 基因检测，确定存活植株是否为携带抗性基因的后代。检测 基因及 基因的 反应体系参考 等的方法，引物见表。表 基因和 基因扩增引物序列及扩增产物大小 基因 上游引物 下游引物 扩增产物大小 以 为父本的杂交后代鉴定：根据杂草稻具有红色果皮基因（），栽培水稻具有白色果皮基因（），栽培水稻的白色果皮基因（）相比杂草稻的红色果皮基因（）缺失 ，判断 种杂草稻的理论扩增片段应为 ，的理论扩增片段为 ，与杂草稻的杂交后代理论扩增片段应包括 和 。检测 基因的 反应体系参考 等的方法。采用 检验（），验证、抗性分离比结果是否分别符合 和 的孟德尔遗传定律。抗草甘膦基因为显性单基因，因此 性状分离比理论值为，是由筛选后的 自 第 期李雷，等：复合性状转 基因水稻 与杂草稻、的适合度交获得，因此抗性分离比理论值为。秧苗移栽 经鉴定后，从确定的以 为父本的抗性杂交后代和以 为父本的杂交后代中选择大小一致、生长健壮的幼苗移栽。试验共设 个处理（每种材料为 个处理），每个处理重复 次，采用随机区组设计。每小区种植 株，株间距为 ，小区之间间隔 ，试验期间以人工拔除的方式保持小区内无杂草。靶标虫压测定 水稻生长至孕穗期，参照 等的方法进行靶标虫压调查，统计由稻纵卷叶螟、二化螟、三化螟等鳞翅目害虫造成的受损叶片、枯孕穗及白穗，计算卷叶率和枯穗率。卷叶率卷叶数 总叶片数，枯穗率枯穗数 总穗数，靶标虫压卷叶率（）枯穗率（）。营养和生殖生长指标测定 每个小区内 株供试材料全部进行测定。在水稻黄熟期，测定株高、有效分蘖数；收获后测定穗长、单穗饱满粒数、结实率、百粒重、单株产量和单株干生物量。结实率单株饱粒数 单株总粒数。落粒率 各试验材料在收获后立即进行落粒率测试。每个小区随机选取 株，剪下每株供试材料的主茎稻穗后从 处自由坠地，连续重复 次，统计脱落与未脱落的饱满粒数，并计算落粒率。落粒率脱落饱满粒数 单穗总饱满粒数。种子埋藏越冬能力 将收获的种子放置在室温通风环境中 进行萌发试验。选取供试材料各 粒种子，重复 次。每种供试材料消毒洗净后，放入装有 层滤纸的盘子中，加入约 蒸馏水。置于光照 黑暗时间为 及（）（）的条件下培养 ，统计萌发与未萌发种子数，并计算萌发率：萌发率萌发种子数 总种子数，作为埋藏前种子发芽率。设置浅埋（）和深埋（）种埋藏深度。选取供试材料各 粒种子，分装于 尼龙网袋中，每种供试材料 次重复。埋藏试验地点为适合度试验水泥池中。分别在埋藏、和 后，取出并统计已腐烂的和已发芽的种子，剩余种子进行室内萌发试验，种子萌发测定的方法同埋藏前种子萌发率测定试验。培养 后，分别统计萌发与未萌发的种子数。采用 染色法对未萌发种子进行活力测定。有活力的种子数为已萌发的种子、发芽试验中萌发的种子及 染成红色的种子数之和。数据统计各测量数据以小区为单位，分析靶标虫压、营养和生殖生长指标、落粒率及种子埋藏不同时间后的活力种子率，对 与 之间的差异运用 软件中的独立样本 检验（）分析；对、与、及相应杂草稻之间的差异运用 中的 氏新复极差测验（）。图表中不同小写字母表示在 水平上的差异显著性。以、非抗性杂交后代和 种杂草稻的各项营养和生殖生长指标为，与、抗性杂交后代与非抗性杂交后代、抗性杂交后代与相应杂草稻的各项指标比值的平均值为总相对适合度。运用 中的独立样本 检验比较 与、抗性后代与非抗性后代、抗性杂交后代与相应杂草稻总相对适合度的差异。运用 中的 氏新复极差测验，分析抗性后代的总相对适合度差异。图 以 为父本、杂草稻为母本的 的 基因检测.；结果与分析 以 为父本的抗性 鉴定以 为父本的 生长至 叶期时喷施草铵膦 周后，选取存活植株叶片进行 和 基因的检测，均检测到 的 基因和 的 基因片段（图），说明试验所用（用 表南 京 农 业 大 学 学 报第 卷示）均含有 和 基因，为真杂交种。以 为父本的杂交后代鉴定以 为父本的（用 表示）均检测到 和 的目的片段，说明供试材料 为真杂种（图）。、的鉴定方法同，用于试验的、均为检测到 和 目的片段的植株。图 以 为父本、杂草稻为母本的 的 基因检测.；抗性基因在 和 中的遗传规律喷施草铵膦溶液后，的幼苗均生长正常。种杂草稻叶片失绿、黄化，逐渐枯死。以 为父本的杂交后代中部分植株为健康植株，部分植株受严重药害，接近死亡。将叶片绿色健康的幼苗作为抗性植株，且经分子检测发现存活植株均携带 基因及 基因；将叶片发生黄化枯萎的幼苗作为非抗性植株进行统计，经分析抗性植株与非抗植株的抗性分离比例符合孟德尔遗传定律（表、表）。这说明抗草铵膦性状是显性单基因控制的性状。表 与 种杂草稻杂交 的抗性分离比及检验 试验材料死亡植株数 存活植株数 植株总数 存活率 抗性种子数非抗种子数值（）注：表示卡