二甲双胍对PCOS大鼠下丘...spepetin表达的影响_唐优.pdf

81安徽医专学报 2023 年 22 卷第 1 期二甲双胍对PCOS大鼠下丘脑Kisspepetin表达的影响唐 优1 陆雅婷2 郑萍萍1 程媛媛1 袁金金1 左 俊1 邓大同2【中图分类号】R589.25【文献标识码】【文章编号】2097-0196（2023）01-0081-04【摘 要】目的：研究多囊卵巢综合征发展过程中下丘脑Kisspeptin-1(Kiss1)表达变化，以及二甲双胍干预后下丘脑Kiss1表达的改变及对多囊卵巢综合征的影响。方法：使用来曲唑灌胃构造多囊卵巢综合征大鼠模型，造模成功后，通过二甲双胍用药干预多囊卵巢综合征大鼠，然后观察多囊卵巢综合征大鼠卵巢形态、动情周期、胰岛素抵抗、性激素、下丘脑Kiss1表达的变化。结果：多囊卵巢综合征大鼠动情周期紊乱，出现胰岛素抵抗，睾酮及促黄体生成素上升，卵巢呈多囊样改变，下丘脑Kiss1表达增加，二甲双胍的干预可改善上述生殖和代谢紊乱，同时降低下丘脑Kiss1表达。结论：下丘脑Kiss1的表达可能在PCOS发病机制中起重要作用，而二甲双胍可能通过改善胰岛素抵抗来降低下丘脑Kiss1表达，从而改善PCOS大鼠生殖及代谢障碍。【关键词】PCOSKisspeptin二甲双胍来曲唑doi：10.20072/ki.issn2097-0196.2023.01.029多囊卵巢综合征（PCOS）是育龄期女性常见的内分泌代谢异常、生殖功能障碍的疾病1，患者主要表现为高雄激素血症（HA），卵巢多囊样改变，排卵障碍，胰岛素抵抗（IR）等，其中IR和HA是PCOS发生发展的重要机制。调查发现2020年中国育龄妇女PCOS患病率达到7.8%2，其中约60%70%PCOS患者合并糖代谢异常3，因此改善IR成为了治疗PCOS的重要目的。二甲双胍是第一种用于治疗PCOS的胰岛素增敏药物，通过减少肝内糖异生，使外周组织对胰岛素的敏感性增加，进而减轻胰岛素抵抗情况4，对PCOS女性无排卵、高胰岛素血症、IR等有着积极改善的作用。鉴于PCOS的临床异质性，其病因及机制有待进一步探究，其中下丘脑-垂体-卵巢轴（HPG）的作用较为重要。下丘脑促性腺激素释放激素（GnRH）神经元分泌GnRH，促使腺垂体分泌黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH），最后作用于性腺，PCOS患者的GnRH及LH脉冲频率增加、FSH减少，影响了下游的卵巢，表现为雄激素增多，卵泡发育障碍，从而导致PCOS患者出现月经失调、痤疮、不孕、多毛、肥胖等临床特征。Kisspeptin是 由KISS1基 因 编 码 的 神 经 肽，对维持女性正常的生殖功能、协调性激素反馈起到不可或缺的作用。Kisspeptin神经元主要分布在下丘脑弓状核（ARC），其通过与GnRH神经元上表达的G蛋白偶联受体54（GPR54）结合，刺激GnRH释放到门脉循环中，增强垂体前叶对LH和FSH的分泌。多项研究提示5PCOS患者血清Kisspeptin水平和LH水平有相关性，表明Kisspeptin通过HPG轴影响排卵功能导致PCOS发生，进而引起糖脂代谢异常。本实验通过来曲唑灌胃诱导的PCOS大鼠模型，随后通过二甲双胍用药干预，观察PCOS大鼠代谢和生殖障碍能否得以改善，以及下丘脑Kisspeptin的表达变化，从而进一步验证Kisspeptin在能量代谢与生殖功能的作用，证实二甲双胍治疗PCOS具有可靠的理论依据。1 材料和方法1.1材料实验动物：健康SPF级雌性大鼠30只，56周龄，体质量约170g，购自并饲养于安徽医科大学的实验动物室，饲养环境为恒温18 22，适应性饲养3天。主要试剂：盐酸二甲双胍片（规格0.5g），来曲唑（规格100mg），ELISA试剂盒，KISS1Antibody。主要仪器：罗氏血糖仪，组织包埋机，石蜡切片机，双目显微镜。1.2方法PCOS大鼠的模型建立及治疗：将大鼠随机分为空白组（n=12只）与模型组（n=18只），模型组采用来曲唑（1mgkg-1d-1来曲唑，溶解于1%羧甲基纤维素钠）灌胃，通过持续灌胃28天，构造pcos大鼠模型，空白组大鼠给予等量的1的CMC溶液灌胃28天，随后空白组及模型组各随机抽取6只，观察卵巢形态结构，评估造模成功率。将模型组余下大鼠随机分为二甲双胍组（n=6只），和来曲唑组（n=6只），二甲双胍组采用二甲双胍灌胃（二甲双胍300mgkg-1d-1，溶于生理盐水），连续灌胃21天，同期来曲唑组与空白组（n=6只）予以每日灌服等量的生理盐 作者单位：1.安徽医科大学第一附属医院全科医学科 安徽合肥 230022 2.安徽医科大学第一附属医院内分泌科 安徽合肥 230022基金项目：2017年安徽医科大学第一附属医院博士基金(1313号)安徽省高校科学研究重点项目（编号：2022AH051141）通信作者：邓大同,男，主任医师，副教授，硕士生导师2022-12-03收稿，2023-01-16修回医学基础与药学研究医学基础与药学研究82水，连续灌胃21天。本实验经实验动物伦理委员会审查通过。大鼠动情周期：在造模第1928天，用药干预后的第1221天，每天8：00取大鼠阴道脱落细胞进行涂片，在双目显微镜下进行细胞形态观察，判断大鼠的动情周期。检测空腹血糖水平：末次用药干预后，禁食大鼠12h，检测空腹血糖水平（FBG，mmolL-1）。取材：采取0.1%水合氯醛（3mL/1kg）腹腔注射麻醉大鼠，卵巢石蜡包埋，通过苏木精-伊红染色来观察大鼠卵巢组织学形态，收集血清标本，将下丘脑行石蜡切片保存待用。性激素及胰岛素检测：按照ELISA试剂盒操作规程检测卵泡刺激素（FSH）、血清睾酮（T）、黄体生成激素（LH）、胰岛素（INS）的水平，并计算胰岛素抵抗指数：HOMA-IR=空腹血糖水平（FBG，mmolL-1）空腹胰岛素水平（FINS，mUL-1）/22.5。免疫组织化学染色：先用4%多聚甲醛固定卵巢24h，随后通过洗涤脱水透明透蜡包埋切片封片烤片。再次脱蜡复水苏木精染色水洗分化伊红染色脱水透明封藏，最后进行显微镜拍照。1.3 统计学分析 图表采用GraphPadPrism9.4.1制作，使用SPSS26统计学软件进行数据分析，所有数据均进行正态分析，正态数据以均数标准差表示，多组数据比较采用单因或多因素方差分析，组间数据比较采用Tukey法，非正态分布资料采用秩和检验。P0.05表示差异有统计学意义。2 结 果2.1二甲双胍可改善来曲唑诱导的PCOS大鼠胰岛素抵抗来曲唑造模构建的PCOS大鼠空腹血糖较生理盐水组大鼠的空腹血糖增高（P0.05，如图1A），行药物干预后，二甲双胍组较来曲唑组比较，空腹胰岛素明显降低（P0.01，如图1B），胰岛素抵抗指数下降（P0.01，如图1C），以上结果表明来曲唑构造PCOS大鼠可有IR产生，二甲双胍可改善PCOS大鼠IR。nsFBG(mmol/L)生理盐水组生理盐水组生理盐水组来曲唑组来曲唑组来曲唑组二甲双胍组二甲双胍组二甲双胍组FINS(mU/L)HOMA-IR8642012010080604020036322824201612840nsnsnsABC注：A：各组大鼠空腹血糖（n=6）；B：各组大鼠空腹胰岛素（n=6）；C：各组大鼠胰岛素抵抗指数（n=6），结果表示为均数标准差。ns：无显著性差异，*P0.05，*P0.01，*P0.001图1 各组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素、胰岛素抵抗指数水平比较2.2二甲双胍改善PCOS大鼠动情周期在造模第1928天，空白组及模型组行阴道脱落细胞涂片，空白组大鼠均表现为动情前期动情期动情后期动情间期的规律性变化，每个周期约 45 天（如图 2A），模型组失去规律动情周期，表现为持续间期（如图 2B）。表明来曲唑构造PCOS大鼠，可使大鼠动情周期紊乱，提示排卵障碍。用药干预第 12 天开始对来曲唑组，二甲双胍组进行阴道涂片，结果显示来曲唑组依旧表现为持续间期（如图 2C），二甲双胍组动情周期表现为 56 天动情周期（如图 2D）。以上表明二甲双胍能良好的改善PCOS大鼠动情周期紊乱。ABlankDay0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100123456789100 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10012345678910012345678910012345678910012345678910012345678910DayDayDayDayDayDayDayPEMDPEMDPEMDPEMDPEMDPEMDPEMDPEMDModelMetforminLetrozoleCBD注：A：空白组动情周期变化，呈前期，动情期，后期，间期规律性改变；B：模型组动情周期变化，呈持续间期；C：来曲唑组动情周期变化，呈持续间期；D：二甲双胍组动情周期变化，呈前期，动情期，后期，间期规律性改变。每组取2只大鼠展示。图中P代表动情前期，E代表动情期，M代表动情后期，D代表动情间期图2 各组大鼠动情周期曲线图代表2.3二甲双胍改善PCOS大鼠卵巢组织形态为验证造模效果，造模结束后随机抽取空白组6只，模型组6只观察大鼠卵巢组织形态学，空白组镜下可见大小不一的卵泡，颗粒层较厚（如图3A所示），而模型组镜下见囊状扩张卵泡，颗粒层明显变薄，多为12层（如图3B所示）。结合模型组大鼠动情周期呈持续间期，验证大鼠造模成功。用药干预结束后，二甲双胍组大鼠卵巢囊状卵泡减少，且颗粒层增厚，可见各级卵泡及黄体（如图3C）。表明二甲双胍可促进PCOS大鼠卵泡正常发育，改善卵巢多囊样形态。注：A：空白组大鼠卵巢组织形态（n=6只），B：模型组大鼠卵巢形态（n=6只），C：二甲双胍组（n=6只）图3 各组大鼠卵巢组织形态HE染色镜下图2.4大鼠血清性激素影响来曲唑诱导的PCOS大 鼠 的T高 于 生 理 盐 水 组 大 鼠（P0.05，图4A），同PCOS患者HA相符，二甲双胍用药干预后83安徽医专学报 2023 年 22 卷第 1 期的PCOS大鼠，T有所降低，且具有统计学意义（P0.05，图4A）。来曲唑组大鼠的LH较生理盐水组明显升高（P0.001，图4B），与PCOS患者表现出高LH脉冲相似，二甲双胍用药干预可降低LH（P0.001，图4B）。FSH在各组大鼠间均未见明显差异（如图4C）。ABCnsnsnsnsnsT(nmol/mL)LH(pg/mL)FSH(g/m)30201001086420120100806040200生理盐水组生理盐水组生理盐水组来曲唑组来曲唑组来曲唑组二甲双胍组二甲双胍组二甲双胍组注：A：各组大鼠的睾酮水平；B：各组大鼠的黄体生成素水平；C：各组大鼠的卵泡刺激素水平。ns：无显著性差异，*P0.05，*P0.001图4 各组大鼠的性激素水平比较2.5二甲双胍可改善PCOS大鼠模型下丘脑中Kiss1基因表达 Kisspepetin主要表达在大鼠下丘脑ARC，对各组大鼠下丘脑ARC切片进行免疫组织化学染色，随机取切片23个视野进行统计分析，结果示经来曲唑构造的PCOS大鼠模型下丘脑ARCKisspeptin细胞数明显增加（P0.001，如图5A），用药干预后的二甲双胍组Kisspeptin表达较来曲唑组减低（P0.001，如图5A）。生理盐水组来曲唑组二甲双胍组Ans120100806040200ARCKiss1cells注：A：各组大鼠ARC Kisspeptin阳性细胞数比较，棕黄色颗粒为Kisspeptin阳性细胞。ns：无显著性差异，*P 0.001。B：空白组大鼠ARC Kisspeptin阳性表达图。C：来曲唑组大鼠ARC Kisspeptin阳性表达图。D：二甲双胍组大鼠ARC Kisspeptin 阳性表达图图5 各组大鼠Kiss阳性细胞数比较3 讨 论在本实验中，我们使用来曲唑持续灌胃，成功构造了具有卵巢多囊样改变、动情周期紊乱、胰岛素抵抗、高雄激素血症等表型的PCOS大鼠，经过二甲双胍用药干预后，PCOS大鼠的胰岛素水平及胰岛素抵抗指数明显下降。既往研究证明PCOS中HA与IR互相影响，IR、高胰岛素水平会通过不同途径导致