复合诱变选育高产赤藓糖醇解脂亚罗酵母及其发酵工艺优化_刘芳美.pdf

核 农 学 报 2023，37（5）：09070916Journal of Nuclear Agricultural Sciences复合诱变选育高产赤藓糖醇解脂亚罗酵母及其发酵工艺优化刘芳美 夏凯*彭艳婷 赵学群 沙如意 黄俊*（浙江科技学院生物与化学工程学院，浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室/浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心，浙江 杭州 310023）摘 要：为获得赤藓糖醇高产菌株，以解脂亚罗酵母WT5为出发菌株，采用60Co-射线和常压室温等离子体（ARTP）对其进行复合诱变处理。为进一步提高赤藓糖醇产量，采用单因素筛选结合 Plackett-Burman（PB）试验方法优化培养基组成，同时对培养模式进行改进。结果表明，复合诱变能有效提升解脂亚罗酵母性能，其中60Co-射线最佳辐射剂量和ARTP最优处理时间为1 200 Gy、60 s。诱变处理后获得优良菌株CA20，其赤藓糖醇产量为60.80 gL-1，是出发菌株WT5的2.41倍。此外，PB拟合结果确认发酵最优培养基组分为：43 gL-1葡萄糖、1.92 gL-1酵母浸出粉、2.98 gL-1蛋白胨、4.70 mgL-1硫酸铵、6.85 gL-1氯化钠、3.30 mgL-1磷酸二氢钾、0.65 mgL-1维生素B1、49 mgL-1肌醇六磷酸、193 mgL-1司班20、7 mgL-1吐温80、0.42 mgL-1硫酸镁、0.002 mgL-1硫酸亚铁，装液量 21 mL，初始pH值5.98。该条件下赤藓糖醇产量可达122 gL-1，得率为0.57 gg-1。最后，在3.7 L发酵罐中，采用两阶段pH值调控的方法可显著提升CA20赤藓糖醇产量和得率，分别为156 gL-1和0.58 gg-1，显著高于分批发酵中的131 gL-1和0.54 gg-1。本研究结果为赤藓糖醇高产菌株的诱变选育提供了重要信息。关键词：赤藓糖醇；60Co-射线；常压室温等离子体；甜味剂；发酵工艺DOI：10.11869/j.issn.1000-8551.2023.05.0907目前，因糖过量摄入造成的健康问题给人们的生活造成了困扰1-2。而甜味剂的发现和使用有助于降低食品中糖的添加量，从而减少了糖的摄入。近年来，作为天然甜味剂的赤藓糖醇（erythritol）凭借独特的理化性质，如热值低、基本不被人体代谢、稳定性高和食用不会引起肠道不适等受到广泛关注3。赤藓糖醇化学名为（2R，3S）-butane-1，2，3，4-丁四醇，是一种白色、无味、不吸湿、无光学活性、热稳定性好且易溶于水的四碳醇，广泛存在于水果、蔬菜和发酵食品中。目前，赤藓糖醇已被广泛用于食品、医药和化工产品中，市场需求量急剧上升，这对赤藓糖醇的生产提出了新的要求4。赤藓糖醇可以通过化学法和微生物发酵法合成，然而化学合成法存在生产效率低、成本高和操作危险等缺点1；微生物发酵法生产过程温和且容易控制，是现今赤藓糖醇生产的主要途径1。赤藓糖醇主要由酵母菌发酵生产，已知的赤藓糖醇高产菌种来源于假丝酵母属（Candida）、亚罗酵母属（Yarrowia）和圆酵母属（Torula）等，其中被认为是安全微生物（generally regarded as safe，GRAS）的解脂亚罗酵母（Yarrowia lipolytica）是赤藓糖醇生产中使用最多的菌种5-6。然而，目前能够用于大规模生产赤藓糖醇的工业菌种资源仍相对匮乏，已报道的不同菌种间性能差异显著。因此，菌种选育仍然是现阶段重要的基础性工作。诱变处理是提高菌种性状的重要途径，针对赤藓糖醇生产菌株，目前采用的主要诱变方法为紫外线（ultraviolet，UV）辐射、硫酸二乙酯（diethyl sulphate，DES）和氯化锂（LiCl）分别处理等7-8。相比于紫外线辐射，射线诱变因便于控制辐射条件、试验重复性好等特点，已在生物育种中得到普遍应用9-10。此外，常压室温等离子体（atmospheric and room temperature 文章编号：1000-8551（2023）05-0907-10收稿日期：2022-08-08 接受日期：2022-10-18基金项目：浙江科技学院科研启动基金（F701103L11），研究生科研创新基金项目（2021yjskc11）作者简介：刘芳美，女，主要从事微生物发酵与育种研究。E-mail：*通讯作者：夏凯，男，讲师，主要从事工业菌种选育和微生物抗逆性研究。E-mail：；黄俊，男，教授，主要从事蛋白质分子设计和定向进化以及合成生物学研究。E-mail：。同为通讯作者。907核农学报37 卷 plasma，ARTP）诱变因操作简单、安全性高、环境友好和突变速度快等特点已在生物高效进化育种中取得了良好的效果11-12。然而，这两项技术在赤藓糖醇生产菌株的诱变选育中尚未得到推广。鉴于此，本研究以解脂亚罗酵母 WT5 为出发菌株，采用60Co-射线辐射和ARTP复合诱变处理，旨在获得一株高产赤藓糖醇且遗传性能稳定的菌株，并探明复合诱变处理的最佳条件及其在解脂亚罗酵母诱变选育中的实用性及高效性。此外，通过对培养基组分的Plackett-Burman（PB）拟合进行优化以及培养模式做出改进，以期进一步提高赤藓糖醇产量，为其他菌种的诱变选育以及赤藓糖醇的发酵生产提供技术参考。1材料与方法1.1材料与试剂赤藓糖醇生产菌种解脂亚罗酵母 WT5（rDNA 序列号为ON527253）分离于水果、蜜饯和蜂蜜混合物，由浙江科技学院生物与化学工程学院生物工程实验室保存。研究中所获高产菌株解脂亚罗酵母CA20保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC：M2022880）。试验中所用化学试剂，如无特殊说明，均为分析纯，采购于生工生物工程（上海）股份有限公司以及国药集团化学试剂有限公司（北京）。菌种活化培养基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）：D-葡萄糖 20 gL-1、酵母浸出粉（Oxoid）10 gL-1、蛋白胨（Oxoid）5 gL-1、NaCl 10 gL-1、KH2PO4 0.5 gL-1，pH值6.0；摇瓶种子培养基和发酵培养基中其他成分不变，葡萄糖浓度分别改为200和330 gL-1，用于诱变后筛选的培养基组分和发酵培养基一致。其他优化后的培养基组分见下文所述，固体培养基在液体成分基础上添加2%（wv-1）琼脂粉。1.2主要仪器设备SpectraMax iD3 全 波 长 多 功 能 酶 标 仪，美 国Molecular Devices公司；Allegra64R台式高速冷冻离心机，美国Beckman Coulter公司；KLF2000 3.7 L全自动发酵罐，瑞士比欧生物工程公司；ZQZY-78AE智能恒温摇床，上海知楚仪器有限公司；e2695高效液相色谱仪，美国Waters公司；ARTP-II型ARTP诱变系统，无锡源清天木生物科技有限公司；Aminex HPX-87H分析柱（300 mm 7.8 mm），美国Bio-Rad公司；2414示差折光检测器；美国Waters公司。1.3试验方法1.3.1射线诱变处理及菌株筛选甘油管保存菌种划线于固体活化培养基，之后置于 30 培养箱静置培养 3 d。挑取单菌落接种于 40 mL 种子培养基，200 rmin-1振荡培养至OD600=3.00.5，之后5 000 rmin-1条件下室温离心收集菌体并使用生理盐水洗涤2次。利用生理盐水悬浮菌体并进行系列稀释，获得每毫升细胞个数为107的菌液，之后对菌液进行60Co-射线辐射处理：辐射剂量为0（空白）、400、800、1 200、1 600和2 000 Gy，试验在浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所辐照中心完成。诱变完成后，稀释菌液并涂布于含有 0.005%（wv-1）2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride，TTC）的固体筛选培养基（TTC氧化态为无色，在胞内脱氢酶的作用下，TTC作为氢受体可被还原为红色的三苯甲臜，使菌落变红，颜色越深脱氢酶活性越高13）。之后置于黑暗条件培养，观察菌落形态和颜色变化，计算成活菌落数，并计算致死率：致死率=1-（诱变组菌落数/对照组菌落总数）100%。挑取颜色深红且直径大的单菌落进行活化培养，之后转接于发酵培养基进行为期7 d的赤藓糖醇发酵试验（摇瓶容积为500 mL），测定发酵液中赤藓糖醇浓度以作为高产菌株筛选依据，并计算正负突变率。正向突变定义为当突变菌株的赤藓糖醇产量超过出发菌株5%以上且结果差异显著，反之如产量降低5%以上则为负突变，其他则为中性突变。同时对获得的高产菌株进行遗传稳定测试。将备选优良菌株进行活化培养后以1%（vv-1）比例接种于40 mL筛选培养基，进行为期 7 d 的振荡培养（30、200 rmin-1），同时以上一次第2天发酵液作为下一次转接的种子液，连续转接 20次，每次发酵结束后测定培养液中赤藓糖醇浓度。保存性状优良菌株用于后续试验。1.3.2ARTP 诱变处理及菌株筛选菌种的活化和菌悬液的制备过程参照1.3.1所述，菌悬液的制备改用无菌水，无菌条件下将载片置于酒精灯外焰灼烧30 s，待冷却后放到已灭菌培养皿中，取10 L菌液均匀涂布于载片表面。之后进行ARTP诱变：处理距离2 mm；处理功率100 W；气流量8 SLM；处理时间为0、20、40、50、60、70、80和 100 s。诱变结束后将载片放至 1 mL无菌生理盐水中制备菌悬液，经不同倍数稀释后涂布于含TTC的固体筛选培养基。ARTP试验由无锡源清天木生物科技有限公司完成，高产菌株的筛选和遗传稳定性试验参照1.3.1进行。1.3.3培养基单因素试验选取100500 gL-1葡萄糖（C6H12O6H2O）、015 gL-1酵母粉、05 gL-1蛋白胨、09085 期复合诱变选育高产赤藓糖醇解脂亚罗酵母及其发酵工艺优化20 gL-1氯化钠、0100 mgL-1硫酸铵、0500 mgL-1磷酸二氢钾、0100 mgL-1维生素B1、050 mgL-1肌醇六磷酸、0400 mgL-1司班 20、010 mgL-1吐温 80、020 mgL-1硫酸镁（MgSO47H2O）、01 mgL-1硫酸亚铁（FeSO47H2O）、020 mgL-1硫酸铜（CuSO45H2O）、020 mgL-1硫酸锌（ZnSO47H2O）、020 mgL-1硫酸锰（MnSO4H2O）、020 mgL-1氯化钙，以及初始pH值46和装液量2060 mL进行单因素试验，每组成分选择5个浓度梯度，每组设置3次平行试验，以赤藓糖醇浓度为指标确认单因素的最佳条件。用于单因素试验的基本培养基组成及培养条件：330 gL-1葡萄糖、5 gL-1酵母浸出粉、5 gL-1氯化钠、0.5 gL-1磷酸二氢钾，初始pH值6.0，装液量40 mL，发酵周期168 h。1.3.4Plackett-Burman(PB)试验设计根据单因素试验结果，依据Design-Expert 8.0.6.1软件中的PB设计原理，选取葡萄糖（A）、酵母粉（B）和蛋白胨（C）等14个因素进行三水平的试验设计及数据处理，以确定影响显著的因素以及最佳培养基组成。因素水平设计见表1。1.3.5赤藓糖醇发酵试验及相关指标测定1.3.5.1 摇瓶发酵试验 挑取诱变后生长较快且颜色较深单菌落于5 mL YPD培养基中进行过夜活化培养，之后以5%（vv-1）比例接种于40 mL发酵培养基中进行为期7 d的连续培养，发酵结束后取样测定发酵液中赤藓糖醇浓度。1.3.5.2 罐上分批发酵试验（batch fermentation，BF）挑取单菌落过夜活化培养，之后以 5%比例转接于30 mL种子培养基（250 mL 摇瓶）中，于30、200 rmin-1条件下培养24 h，制备一级种子液，随后以5%比例转接于80 mL种子培养基（500 mL 摇瓶）中培养制备二级种子液，之后以10%比例转接于2.