多重实时荧光PCR_Taq...鉴定转基因玉米MIR162_王凤军.pdf

多重实时荧光 PCR TaqMan-MGB 杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米 MIR162王凤军，许海锋，陈强，杨伊平，金浩然（浙江经贸职业技术学院,浙江杭州310018）摘要：为对转基因玉米 MIR162 的进口实行监测、规范转基因玉米在国内市场中的流通，建立一种转基因玉米 MIR162 准确快速的检测方法，通过设计转基因玉米 MIR162 品系特异性序列的引物和探针，摸索和优化多重荧光 PCR 体系和参数，开发建立多重实时荧光 PCR TaqMan-MGB 杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米 MIR162。结果表明，转基因玉米 MIR162 品系标准品和平行样品中内标基因和品系特异性基因均出现明显扩增曲线，其他转基因玉米品系标准品仅内标基因有扩增曲线，空白对照无扩增曲线，说明该 TaqMan-MGB 探针对转基因玉米 MIR162 品系具有扩增特异性。该方法可作为鉴定筛查转基因玉米 MIR162 品系及其转化体成分的有效方法，用于规范管理转基因产品在市场上的流通。关键词：转基因玉米 MIR162；多重实时荧光 PCR；TaqMan-MGB 杂交探针标记法；快速鉴定Rapid Identification of Transgenic Maize MIR162 by MultipleReal-Time Fluorescent PCR with TaqMan-MGBHybridization Probe LabelingWANG Feng-jun,XU Hai-feng,CHEN Qiang,YANG Yi-ping,JIN Hao-ran（Zhejiang Institute of Economic and Trade,Hangzhou 310018,China）Abstract:In order to monitor the import of transgenic maize MIR162 and standardize the circulation of transgenicmaize in domestic market,an accurate and fast detection method for transgenic maize MIR162 was established.Bydesigning primers and probes for the specific sequence of transgenic maize MIR162,the multiple fluorescent PCRsystem and parameters were explored and optimized,and a multiple real-time fluorescent PCR with TaqMan-MGB hybridization probe labeling method for rapidly identifying transgenic maize MIR162 was developed andestablished.The results showed that the internal standard gene and line-specific gene of transgenic maize MIR162line standard and parallel samples presented obvious amplification curves,and only the internal standard gene ofother transgenic maize line standards exhibited amplification curves,while the blank control had no amplificationcurves,indicating that the TaqMan-MGB probe had amplification specificity for transgenic maize MIR162 strain.This method can be used as an effective method to identify and screen transgenic maize MIR162 strains andtransformant components,and can be applied for regulating the circulation of transgenic products in the market.Key words:transgenic maize MIR162;multiplex real-time fluorescent PCR;TaqMan-MGB hybridization probelabeling method;rapid identification基金项目：浙江经贸职业技术学院省属高校基本科研业务费项目（20SBYB03）；浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划（2021R444003）作者简介：王凤军（1984），女，汉族，硕士，高级实验师，主要从事转基因高通量检测技术研究。保鲜与加工Storage and Process2023，23（3）：56-61检 测 分 析56投稿平台：2023年第3期中图分类号：S513DOI：10.3969/j.issn.10096221.2023.03.009文献标识码：A随着时代科技的进步，转基因作物研究不断推进并完善，转基因作物的种植面积也逐年增加。其中，转基因玉米在转基因作物中占据着重要地位，种植面积逐年稳步上升。自上世纪 80 年代以来，玉米转基因技术迅猛发展，当前已经培育出抗虫、抗旱、抗除草剂、抗病等多种转基因玉米1。我国在 2001 年颁布，2017 年修订的农业转基因生物安全管理条例2和 2002 年颁布，2017 年修订的 农业转基因生物标识管理办法3等法规相继规定了在中国销售的列入管理标识目录中的含有转基因成分的农产品或食品，都需要明显的标识，其中包括玉米种子、玉米油、玉米、玉米粉等1。2021 年初，农业农村部办公厅制定了 2021 年农业转基因生物监管工作方案4，要求严格落实 中华人民共和国生物安全法5中华人民共和国种子法6等法律法规，坚持“两手抓”“两促进”，既要加快推进生物育种研发应用，又要依法依规严格监管，因此在研究如何保证玉米产业持续发展，出具法规保障消费者权益的同时，还需对转基因玉米的品系筛查鉴别技术进行研究。目前，鉴定转基因作物的检测方法种类繁多，主要有核酸成分检测和蛋白质检测两个方向，常用的有聚合酶链式反应（PCR）检测技术、基因芯片技术、环介导等温扩增技术、酶联免疫吸附法和胶体金免疫层析法等2。现在，市面上很多检测方法操作难度高、成本损耗过大、特异性差、没有高通量特征，有时还会出现假阳性。PCR 检测是实验室首选的检测方法，常用于转基因农作物特有外源基因的检测以及单重或多重品系鉴定7-8。除了应用最为普遍的常规 PCR 外，还有在 PCR 扩增技术原理基础上开发出的一系列延伸方法，如多重 PCR 技术、数字 PCR技术以及实时荧光PCR 技术等。其中，实时荧光 PCR 检测技术是目前发展成熟，应用较为广泛的方法。根据常规 PCR 检测原理，在反应体系中添加荧光染料或特异性引物探针，并在实时荧光 PCR 仪上进行产物扩增，实时监控扩增过程，并用已知标准物质与未知样品进行定性比较9-13。转基因玉米 MIR162 品系是由美国先正达公司利用 DNA 重组技术培育而成的具备抗虫性的转基因玉米14。本研究主要针对该品系特异序列设计引物和荧光探针，以基因组 DNA 为模板通过qPCR 反应判断待检样本是否包含重组序列，进而建立该品系的快速检测技术。1材料与方法1.1材料与设备1.1.1材料与试剂转基因玉米MIR162标准品、转基因玉米MON89034标准品、转基因玉米 MON810 标准品、转基因玉米MON863 标准品、转基因玉米 Bt176 标准品，均购自于深圳安莱尔科技公司；非转基因玉米中农甜 488，购自河间市萌芽种子销售有限公司。KoningR通用型基因组 DNA 小量制备试剂盒，杭州百迈生物股份有限公司；实时荧光 PCR 检测试剂盒，50 bp，1 kb DNA Ladder，宝生物工程（大连）有限公司；探针与引物，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。1.1.2仪器与设备ABI7500 实时荧光定量 PCR 仪，美国应用生物系统公司；ND2000C 核酸蛋白分析仪，美国热电公司；1-14ED 小型离心机，德国西格玛公司。1.2方法1.2.1转基因玉米检测标准查询通过国家标准化管理委员会、农业农村部和国家质量监督检验检疫总局查询关于转基因检测的相关国家标准和行业标准。通过筛查，发现与转基因玉米相关的标准近70项，具体分析有关转基因玉米 MIR162品系的检测标准 2 项，分别是 GB/T 19495.42018转基因产品检测实时荧光定性聚合酶链式反应（PCR）检测方法15、农业部 2031 号公告-6-2013 转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米 MIR162 及其衍生品种定性 PCR 方法16。1.2.2样品 DNA 的提取称取 1 份转基因玉米 MIR162 标准品作为阳性对照，转基因玉米 MON89034 标准品、转基因玉米MON810 标准品、转基因玉米 MON863 标准品、转基因玉米 Bt176 标准品各 1 份为阴性对照，每份 25 mg。按照 KoningR通用型基因组 DNA 小量制备试剂盒说明书进行 DNA 提取纯化，使用 100 L 灭菌双重蒸馏水（ddH2O）进行洗脱准备，使用离心机在 12 000 r/min王凤军，等：多重实时荧光 PCR TaqMan-MGB 杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米 MIR16257保鲜与加工Storage and Process联系邮箱：2023年第3期试剂最终浓度体积/LTranStartRProbe qPCRSuperMix（2）1010.0Passive R eference Dye0.2 mol/L0.4Primer MIR 162F(10 mol/L)0.1 mol/L0.4Primer MIR 162R(10 mol/L)0.1 mol/L0.4Probe MIR 162(10 mol/L)0.1 mol/L0.2Primer zSSIIbF(10 mol/L)0.1 mol/L0.2Primer zSSIIbR(10 mol/L)0.1 mol/L0.2Probe zSSIIb(10 mol/L)0.1 mol/L0.2DNA 模板2.0 ng/L4.0反应混合液用 ddH2O 补充体积至 20 L表 1多重 TaqMan-MGB 杂交探针标记法的反应混合液组成Table 1R eaction mixture compositions of multiplexTaqMan-MGB hybridization probe labeling method条件下洗脱离心 2 次。DNA 提取后，取 1 L 用核酸蛋白分析仪测定 DNA 的浓度和质量，记录相应的数据信息。DNA 模板于-20 保存待用。1.2.3特异性引物和探针设计通过查询玉米内标基因zSSIIb，转基因玉米MIR 162品系序列信息，在 NCBI 网站搜索全序列和目标序列。根据外源基因和玉米边界序列，使用引物探针设计软件 Primer Express 5.0（Primer express softwarefor real-time PCR,Version 5.0）设计相应的引物和探针。1.2.4单重荧光 PCR反应本试验采用单重荧光 PCR反应检测玉米内标基因 zSSIIb。反应体系设置为：10TranStartRProbe qPCRSuperMix10 L，