哈茨木霉对商洛烟区植烟土壤细菌多样性的影响_穆耀辉.pdf

哈茨木霉对商洛烟区植烟土壤细菌多样性的影响穆耀辉，任志超，李淑娥，张永峰，任天宝，张松涛，姬小明，王 景，殷全玉，刘国顺（陕西省烟草公司商洛市公司，陕西商洛；河南农业大学烟草学院，河南郑州）摘要 探究哈茨木霉对植烟土壤细菌多样性与群落结构的影响，为优化轮作烟草根际土壤的细菌群落结构、物种组成及土壤的可持续发展奠定了一定的基础。采用大田试验方法，设置（常规施肥）和（常规施肥哈茨木霉菌剂 ）个处理，通过高通量测序技术探究施用哈茨木霉对各处理土壤细菌多样性、菌落结构及理化指标的影响。结果表明，哈茨木霉菌剂的施用降低了土壤细菌群落结构的 多样性指数，与常规施肥相比，增加了放线菌门（）的丰度，减少了变形菌门（）、绿弯菌门（）及酸杆菌门（）的丰度，土壤全氮和速效钾含量显著提高，分别提高 和。表明在植烟土壤中施加哈茨木霉菌肥可进一步优化植烟土壤细菌群落结构，提高土壤肥力。关键词 木霉；根际土壤；细菌群落；多样性；土壤理化性质；高通量测序中图分类号 文献标识码 文章编号（）：开放科学（资源服务）标识码（）：，（，；，），（）（），（），（），（）（），；基金项目 中国烟草总公司陕西省公司科技项目（）。作者简介 穆耀辉（），男，陕西商洛人，高级农艺师，硕士，从事烟草生产管理技术研究。通信作者，副教授，博士，从事烟草资源微生物利用与土壤保育研究。收稿日期 植物从土壤中汲取养分来完成各种生命活动，意味着土壤是影响甚至决定植物生长发育状况的重要因素，但土壤本身必须发育到一定程度才能满足植物的生长发育需要。土壤微生物作为植物与土壤的桥梁，有促进土壤养分循环、净化土壤污染、调节土壤生态系统稳定等作用。人们通过研究土壤微生物的功能多样性、群落结构及物种种类多样性来阐释土壤生态系统与土壤微生物的关系。由于作物多年连作，生产管理措施不当导致土壤营养流失、土壤微生物群落结构破坏、烟草植株发育不良等，成为制约我国烟草行业发展的重要因素。木霉是自然界中的一类有益生防菌，据统计，木霉对 个属 种的植物病原菌具有良好的生防效果，且具有分布广、适应性强及繁殖快等特点，不仅对多种植物病原菌具有拮抗作用，还可以改善作物根际土壤微生物群落结构。张丽荣等在西瓜根际土壤中施加木霉制剂可显著提高土壤中有益微生物的含量，有效改善了土壤根际微生态效应。刘正洋等通过施用木霉生物有机肥发现土壤微生物群落结构和组成发生改变，白菜甘蓝连作体系产量明显提高。扈进冬等通过对小麦与哈茨木霉拌种处理发现土壤中病原真菌的相对丰度显著降低。王义坤等通过在连作土壤中施加哈茨木霉发现土壤根系酶活性及活力明显提高，土壤镰孢菌丰度显著降低，对苹果连作障碍的防控具有良好效果。目前，木霉在小麦、香蕉、棉花等土壤微生物多样性方面的研究已有不少报道，而对于烟草土壤微生物多样性方面的研究鲜见报道。鉴于此，笔者通过高通量测序的方法对施用哈茨木霉菌剂及未施用哈茨木霉菌剂烟株的土壤微生物群落结构及多样性进行分析，探究哈茨木霉菌剂对商洛市植烟土壤微生物多样性的影响，对烟草的生长发育及土壤的可持续发展具有重大意义。材料与方法 试验材料 供试烟草品种为云烟，供试土壤类型为黏壤土，取自陕西省商洛市洛南县，哈茨木霉 菌剂由河南农业大学烟草科教园区微生物实验室制备、保存。试验设计 采用随机区组排列方法，设 个处理，重复 次。处理常规施肥；处理常规施肥哈茨木霉菌剂 ；常规施肥为烟草专用肥（）蚯蚓粪 西洋复合肥（）。试验于 年 月在陕西省商洛市洛南县进行，试验田地势平坦，排灌方便。所用哈茨木霉菌剂的质量要求为活菌数 亿，移栽时使用，与移栽水混匀后灌根即可。安徽农业科学，（）：，土壤取样 在烟草移栽 时，避开雨天和过度干旱期。取样方法参照文献，按照 点取样法在每个处理选取 个取样点，即每个重复 个取样点，利用铲子将烟株周围 的土壤挖至 深，切割土壤中烟株的任何侧根并挖出烟株的整个根部放于盆中，摇动根部用铲子从根部去除土壤，采集 份盆中的土壤，一部分除去各种杂质后混匀过 筛并取 于 无菌离心管中直接干冰运送到上海美吉生物医药科技有限公司进行土壤微生物多样性检测，剩余部分土壤放于密封袋内快速运回实验室 保存并进行理化性质分析。土壤理化性质分析 测定方法参照文献，土壤全氮、全碳用全自动 分析仪（，德国）测定；硝态氮和铵态氮用全自动化学分析仪（，意大利）测定；土壤 用电位法测定；速效磷采用 浸提钼锑抗比色法测定；速效钾采用 乙酸铵浸提火焰光度计法测定。土壤微生物测定分析方法 使用土壤基因组 快速抽提试剂盒对土壤微生物群落进行 的提取，并利用上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序。测序流程分为 扩增、产物的混样与纯化、文库的构建 部分。对细菌 可变区进行 扩增，其引物为（）和（）。扩增程序：预变性，个循环（变性 ，退火 ，延伸 ），之后 稳定延伸 ，最后在 保存。数据分析 采用 软件分析处理数据，用 语言工具制图。结果与分析 哈茨木霉菌剂对土壤化学性质的影响 由表 可知，与 相比，土壤的全碳、铵态氮和速效磷含量分别提高了、且不存在显著差异，土壤的全氮、硝态氮及速效钾含量分别提高了、且与 存在显著差异。说明哈茨木霉菌剂的施用可显著提高土壤全氮、硝态氮及速效钾的含量，虽未显著提高土壤全碳、铵态氮和速效磷的含量，但也稍有提高。表 各处理土壤化学指标 处理全氮全碳 硝态氮 铵态氮 速效磷 速效钾 注：同列不同小写字母分别表示不同处理间差异显著（）。：（）哈茨木霉菌剂对土壤微生物群落结构的影响 样本测序结果。图表示土壤样本中的相同物种及差异物种，抽平后检测到土壤样本的微生物总 数为。由图 可知，和 共有的 总数为 ，各处理所含的特有 总数分别为 和，分别占土壤样本 总数 的 和。总体来看，施加哈茨木霉后烟株根际土壤的 总数比未施加哈茨木霉的有所降低。稀释曲线在细菌群落结构多样性的调查中常用来分析所取样本量是否足够及估计样本群落结构的丰富度。即随机抽取一定数量的序列作为横坐标，多样性指数值为纵坐标，通过观察曲线的平稳程度来判断序列数量是否符合该试验。随着土壤样品量的增加，可能出现测序检测到的物种种类随之增加的状况，由图 可知，当序列数达 时，各土壤样本曲线均居于平缓，并不随着土壤样本量的加大而显著增加，说明土壤样本细菌的总 测序深度足够，细菌群落结构置信度高，此次分析结果可靠。土壤细菌群落的 多样性。多样性指数分析是通过一些统计学指数来分析并评估细菌群落结构的丰度与多样性，指数用来描述样本菌落的覆盖率，即该次测序是否代表真实状况，指数反映了细菌群落结构的丰度，指数和 指数反映了细菌群落结构的均图 各个处理细菌群落 数 匀性。由表 可知，各个样本细菌的 均接近，表明此次测序反映了细菌群落结构的真实性。指数和 指数表现为，而 指数与之相反，由此可知，哈茨木霉的施用降低了植烟土壤群落结构的丰度和均 卷 期 穆耀辉等 哈茨木霉对商洛烟区植烟土壤细菌多样性的影响匀性；从细菌群落结构的丰度来看，虽然 和 处理的 指数不存在显著差异，但数值上还是出现了差距，即降低了，施用哈茨木霉的土壤群落结构丰度要小于常规施肥的土壤群落结构丰度；从细菌群落结构的均匀性来看，各处理的 指数和 指数存在显著差异且施用哈茨木霉的土壤群落结构均匀性显著小于常规施肥的土壤群落结构均匀性，指数降低了，指数增加了，说明哈茨木霉菌剂的施用影响了土壤微生物群落结构。土壤细菌群落结构组成。与 数据库进行比对后，可以得到土壤样本细菌在门水平下 的物种分布图。由图 可知，施用哈茨木霉的土壤与常规施肥的土壤群图 各个处理稀释曲线 表 土壤细菌群落的 多样性 处理辛普森指数香农指数超指数覆盖率 注：同列不同小写字母分别表示不同处理间差异显著（）。：（）落结构在门水平上基本一致，但相对百分比存在差异。相对丰度较高的放线菌门（）、变形菌门（）、绿弯菌门（）及酸杆菌门（）为 个土壤样本的优势物种，相对丰度达 以上。放线菌门（）在施用哈茨木霉的土壤样本中的相对含量高于常规施肥的土壤样本，分别为 和，提高了 百分点；对于变形菌门（），处理相比 处理的相对丰度明显降低了；各个处理绿弯菌门（）和酸杆菌门（）的相对丰度表现为，处理的相对丰度相比 处理分别降低了和。图 土壤细菌群落相对丰度 图根据土壤样本间丰度进行分块聚类，通过颜色的变化来反映土壤样本在不同水平上的相关性，红色越深说明在该水平上土壤细菌生长所受到的促进作用越强，相对丰度也随之越高，蓝色越深说明在该水平上土壤细菌生长所受到的促进作用越弱，相对丰度也随之越低。由图 可知，处理对变形菌门（）、绿弯菌门（）及酸杆菌门（）的促进作用比 处理有所增强，对放线菌门（）的促进作用比 处理有所减弱。图 土壤细菌群落结构聚类热图 土壤细菌群落主成分分析。分析是一种非约束性的数据降维分析方法，用来分析土壤样本群落组成的相关性，如果在 图中的距离越近，则土壤样本的物种组成越相似。由图 可知，和 解释率分别为 和，处理主要集中在坐标轴左侧，处理主要集中在坐标轴右侧，说明 组土壤样本的细菌群落结构组成差异较大。由图 可知，在 轴上 和 处理之间的距离较近，说明哈茨木霉的施用改变了土壤细菌群落结构；和处理之间的箱形长度无明显差异，说明 个处理的重复性一致。土壤细菌群落 分析。根据分类学组成对样本按照不同的分组条件进行线性判别分析（），以此找 安徽农业科学 年出对样本划分产生显著性差异影响的群落或物种。对 和 组土壤样本进行 多级物种差异判别分析来检测具有显著差异的微生物，并采用 线性判断分析来评估每个物种对差异效果影响的程度。由图 可知，在 土壤样本中，变形菌门（）、绿弯菌门（）、及 显著富集；在土壤样本中，放线菌门（）、及脱硫菌门（）发生显著富集。由图可知，变图 土壤细菌群落主成分分析 形菌门（）对 组土壤的群落结构影响最大，而放线菌门（）对 组的土壤群落结构影响最大。图 土壤细菌群落箱型图 优势菌门与土壤化学指标的相关性分析。优势菌门与土壤化学指标的相关系数用来表明环境因子与物种之间的相关程度，挑选相对丰度前 的物种与土壤理化指标进行相关性分析，结果见表。由表 可知，放线菌门与全氮和速效钾的正相关程度最明显为；变形菌门与速效钾的负相关程度最明显为；绿弯菌门和酸杆菌门与铵态氮的负相关程度最明显分别为 和。图 土壤细菌群落 分析 卷 期 穆耀辉等 哈茨木霉对商洛烟区植烟土壤细菌多样性的影响图 土壤细菌群落 线性判断分析 表 优势菌门与土壤化学指标的相关系数 优势菌门全氮全碳硝态氮铵态氮速效磷速效钾放线菌门 变形菌门 绿弯菌门 酸杆菌门 厚壁菌门 芽单孢菌门 拟杆菌门 髌骨细菌门 硝化菌门 讨论土壤细菌的物种多样性指数可反映土壤细菌群落结构的丰富度和多样性。该研究结果发现，施用哈茨木霉菌剂的土壤样本的 指数和 指数均存在显著差异，指数不存在显著差异，但数值上还是出现了差距，说明哈茨木霉菌剂的施用降低了土壤细菌群落的丰富度和多样性。从土壤细菌群落结构的组成可以看出，施用哈茨木霉的土壤与常规施肥的土壤群落结构在门水平上基本一致，相对丰度较高的放线菌门（）、变形菌门（）、绿弯菌门（）及酸杆菌门（）为 个土壤样本的优势物种，这与杨菁等研究结果一致。放线菌是一类抗生素生产菌，通过寄生于植物体内来让植物产生抑菌物质，从而提高植物的抗病性。同时，放线菌门常以孢子形态共存于土壤之中，对植物供给养分，促进植物生长发育。该研究表明，施用哈茨木霉会导致土壤肥力不同程度的提高，其中施用哈茨木霉的土壤中放线菌门（）的相对丰度显著提高，通过分析表明放线菌门（）与土壤全氮和速效钾的含量呈正相关关系，从而导致土壤全氮和速效钾含量的显著提高；放线菌门（）会产生抑菌物质来提高烟株的抗病性且供给更多的养分来促进烟株生长发育。变形菌门（）、绿弯菌门（）及酸杆菌门（）在土壤群落结构中相对丰度减少可能是因为放线菌门（）相对丰度的增加导致土壤中部分养分被竞争，从而相对丰度减少。施用哈茨木霉也会使其他土壤肥力指标的含量不同程度的增加，这是因为施用哈茨木霉可促进土壤中有机质的形成与转化从而提高土壤肥力。结论该研究结果表明，施用哈茨木霉菌