基于RANKL_RANK_...骨质疏松大鼠骨质流失的影响_杨晓净.pdf

doi:10 3969/j issn 1002 7386 2023 02 003论著基于 RANKL/RANK/OPG 信号通路探讨土贝母苷甲对糖尿病性骨质疏松大鼠骨质流失的影响杨晓净邓向群肖婷杨梅项 目 来 源:湖 北 省 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目(编 号:ZRMS2017001529)作者单位:430000湖北省武汉市第三医院光谷院区内分泌科通讯作者:邓向群E-mail:eg269e163 com【摘要】目的探讨土贝母苷甲对糖尿病性骨质疏松(OP)大鼠骨质流失及核因子 B 受体活化因子配体(RANKL)/核因子 B 受体活化因子(RANK)/骨保护蛋白(OPG)信号通路的影响。方法采用高脂高糖饮食+链脲佐菌素腹腔注射法构建大鼠糖尿病性 OP 模型，将 60 只 Wistar 大鼠随机分为对照组、模型组、土贝母苷甲低剂量组(1 mol/L)、土贝母苷甲高剂量组(5 mol/L)、OPG 组(3 mg/kg)、土贝母苷甲高剂量+OPG 组(5 mol/L 土贝母苷甲+3 mg/kg OPG)。酶联免疫吸附(ELISA)法测定大鼠血清核心结合因子 1(CBF-1)、型前胶原氨基端原肽(PINP)、骨钙素(OC)水平;Micro-CT 测定骨密度(BMD)及骨小梁微结构参数;TRAP 染色测定股骨表面破骨细胞数量(N Oc/BS);HE 染色观测大鼠骨组织病理变化;qRT-PCR 法与 Western blot 法分别测定骨组织 RANKL、RANK、OPGmRNA 与蛋白水平。结果与对照组相比，模型组大鼠血清 CBF-1、PINP、OC 水平、股骨最大负荷、断裂挠度、BMD、BV/TV、Tb N、Tb Th、OPG mRNA 与蛋白水平降低(P 0 05)，Tb Sp、N Oc/BS、RANKL mRNA 与蛋白、RANK mRNA与蛋白表达升高(P 0 05);与模型组相比，土贝母苷甲高剂量组、OPG 组血清 CBF-1、PINP、OC 水平、股骨最大负荷、BMD、BV/TV、Tb N、Tb Th、OPG mRNA 与蛋白水平升高(P 0 05)，Tb Sp、N Oc/BS、RANKL mRNA 与蛋白、RANK mRNA 与蛋白表达降低(P 0 05);与土贝母苷甲高剂量组相比，土贝母苷甲高剂量+OPG 组大鼠上述指标均进一步升高或降低(P 0 05)。结论土贝母苷甲可能通过抑制 RANKL/RANK/OPG 通路，减少糖尿病性 OP 大鼠破骨细胞形成，抑制骨流失。【关键词】糖尿病性骨质疏松;核因子 B 受体活化因子配体/核因子 B 受体活化因子/骨保护蛋白;土贝母苷甲【中图分类号】R 587 1【文献标识码】A【文章编号】1002 7386(2023)02 0174 06Exploration on effects of Tubeimoside on bone loss in diabetic osteoporosis rats based on RANKL/RANK/OPGsignaling pathwayYANG Xiaojing，DENG Xiangqun，XIAO Ting，et al Department of Endocrine，Optics Valley Campus，Wuhan Third Hospital，Hubei，Wuhan 430000，China【Abstract】ObjectiveTo explore the effects of Tubeimoside (TBMS1)on the bone loss and receptor activator ofnuclear factor B ligand(RANKL)/receptor activator of nuclear factor B(RANK)/osteoprotegerin(OPG)signalingpathway in diabetic osteoporosis(OP)rats MethodsThe diabetic OP model for rats was set up with the high fat and highsugar diet+intraperitoneal injection of streptozotocin Sixty Wistar rats were randomly assigned into the control group，modelgroup，and low-dose TBMS1 group(1mol/L)，high-dose TBMS1 group(5mol/L)，OPG group(3mg/kg)，high-doseTBMS1+OPG group(5mol/L TBMS1+3mg/kg OPG)Enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)was applied tomeasure the level of serum core binding factor 1(CBF1)，serum procollagen type I N-terminal propeptide(PINP)in rats，and osteocalcin(OC);micro-computed tomography(Micro-CT)was applied to measure the bone mineral density(BMD)and parameters of trabecular bone microstructure;tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP)staining was applied todetermine the osteoclast number on the femur bone surface(N Oc/BS);HE staining was applied to observe the pathologicalchanges of rat bone tissues;the quantitative real-time polymerase chain reaction(qRT-PCR)and Western blot were used todetermine the level of RANKL，RANK，OPG mRNA and proteins in bone tissues，respectively ResultsCompared with thecontrol group，serum CBF1，PINP，OC level，maximum femoral load，fracture deflection，BMD，Bone volume/total volume(BV/TV)，trabecular number(Tb N)，trabecular thickness(Tb Th)，OPG mRNA and protein level of rats in the modelgroup decreased(P 0 05)，and the expression of trabecular separation(Tb Sp)，N Oc/BS，RANKL mRNA protein，RANK mRNA protein increased(P 0 05)Compared with the model group，the serum CBF1，PINP，OC level，maximum femoral load，BMD，BV/TV，Tb N，Tb Th，OPG mRNA protein leve of rats in the high-doseTBMS1 group andOPG group increased(P 0 05)，the expression of Tb Sp，N Oc/BS，RANKL mRNA protein，RANK mRNA and proteindecreased(P 0 05)The above indicators in the high-dose TBMS1+OPG group further increased or decreased comparedwith the high-dose TBMS1 group(P 0 05)ConclusionTBMS1 is capable of reducing theformation of osteoclasts in diabetic OP rats andinhibiting the bone loss by inhibiting the RANKL/RANK/OPG pathway471河北医药 2023 年 1 月 第 45 卷 第 2 期Hebei Medical Journal，2023，Vol 45 Jan No.2【Key words】diabetic osteoporosis;receptor activator of nuclear factor B ligand/receptor activator of nuclear factorB/osteoprotegerin;Tubeimoside 骨质疏松症(osteoporosis，OP)是较常见的代谢性骨疾病，以骨微结构破坏、骨量降低为特征，可增加骨脆性与骨折风险，影响患者健康并增加经济负担1。继发性 OP 常由代谢类疾病引起，糖尿病是导致 OP 的主要原因之一，随着糖尿病进展，胰岛素抵抗与内环境紊乱均可引起骨代谢异常，增加 OP 风险2。糖尿病性 OP 治疗包括生活方式干预、控糖，但收效甚微，因此急需发现安全有效的糖尿病性 OP 治疗药物。土贝母苷甲是五环三萜皂苷家族的成员，从中草药土贝母中提取，传统用于治疗蛇毒与炎症;且土贝母苷甲具有广泛的抗癌特性3。此外，研究显示土贝母苷甲可抑制 NF-B 保护小鼠急性肺损伤4。而 NF-B 通路对于破骨细胞的形成和分化是必不可少，NF-B 是RANKL 诱导破骨细胞分化的重要下游信号5，然而土贝母苷甲对 OP 的直接影响笔者发现尚未被研究。因此，本研究笔者所见通过破骨细胞分化的常用通路RANKL/RANK/OPG 探讨土贝母苷甲对糖尿病性 OP的影响，为糖尿病性 OP 的临床治疗提供理论参考。报道如下。1材料与方法1 1试验动物2 个月龄 Wistar 大鼠 60 只(雄性)，许可证号:SCXK(湘)2019-0015，购自长沙市天勤生物技术有限公司。自然昼夜节律光照(12 h，12 h)，自由饮食饮水，环境湿度为 40%70%。1 2试剂土贝母苷甲(S27647，纯度95%，溶于二甲基亚砜中);OPG(SRP3132)购自默克生命科学官网;SuperScriptTMIV 第 一 链 合 成 系 统(18091050)、EXPRESS One Step SuperscriptTMqRT-PCR 试 剂 盒(11781200)购自赛默飞世尔科技公司;兔抗 RANK、RANKL、OPG、GAPDH 一抗(GTX133795、GTX108515、GTX127948、GTX627408)购自 GeneTex，山羊抗兔二抗(ab6702)购自美国 Abcam 公司;大鼠核心结合因子1(CBF-1)(GT04504B)ELISA 检测试剂盒购自上海晶风生物科技有限公司;型前胶原氨基端原肽(PINP)(ml038224)、骨钙素(OC)(ml002883)ELISA检测试剂盒购自上海酶联;抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)(HR0561)购自北京百奥莱博科技有限公司;HE 染色试剂(G1120)、BCA 试剂盒(PC0020)均购自北京索莱宝。1 3实验方法1 3 1模型制备:Wistar 大鼠适应性喂养 2 周后，随机抽取 10 只作为对照组，其他大鼠均构建糖尿病性OP 模型6，即大鼠以高糖高脂饮食喂养(常规饲料+20%蔗