海南长花龙血树叶的主要蛋白鉴定及其功能分析_何璇.pdf

2023 年 2 月 热 带 农 业 科 学热 带 农 业 科 学 第 43 卷第 2 期 Feb.2023 CHINESE JOURNAL OF TROPICAL AGRICULTURE Vol.43,No.2 收稿日期 2022-07-23；修回日期 2022-08-19 基金项目 海南省院士创新平台科研专项目：海南省科技厅“海南黎药资源化学成分与药理活性研究”（No.YSPTZX202030）。第一作者 何璇（2000），女，学士，研究方向为蛋白质组学，E-mail：。通讯作者 何文英（1969），女，博士，教授，研究方向为化学生物学，E-mail：。海南长花龙血树叶的主要蛋白鉴定及其功能分析 何璇1 黄宇昕2 吴茂霞1 焦晚琪2 赵振东3 何文英2（1.海南师范大学化学与化工学院 海南海口 571158；2.海南师范大学/热带药用资源化学教育部重点实验室 海南海口 571158；3.海南大学/分析测试中心 海南海口 570228）摘 要 长花龙血树是海南黎族药用植物之一，为深入研究开发长花龙血树叶的价值和功能，针对其含有的植物蛋白种类，采用基于 BPP+酚提取法的双向电泳技术，通过优化实验条件，对海南产长花龙血树叶进行蛋白质的提取分离，获得蛋白指纹图谱；利用 Image Master 5.0 软件分析凝胶图像筛选出高表达蛋白；再利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)技术对这些蛋白酶解产物进行质谱鉴定，最后通过生物信息学手段进行蛋白功能初步分析。研究结果表明，海南长花龙血树叶有 60 个高表达的蛋白，通过生物质谱鉴定出 ATP 合酶、核酮糖二磷酸羧化酶大链、叶绿体等 45 个蛋白，涉及长花龙血树叶生长、发育及植物抗逆等多种功能。本研究为进一步开发利用长花龙血树叶中的植物蛋白提供理论依据，对理解海南岛的生态系统服务和生态效益也具有一定的理论和实践意义。关键词 长花龙血树叶；蛋白；功能分析 中图分类号 Q946.1；Q946.91+9 文献标识码 A DOI:10.12008/j.issn.1009-2196.2023.02.008 Identification and Functional Analysis of Main Proteins from the Leaves in Hainan Dracaena angustifolia HE Xuan1 HUANG Yuxin2 WU Maoxia1 JIAO Wanqi2 ZHAO Zhendong3 HE Wenying2(1.College of Chemistry and Chemical Engineering,Hainan Normal University,Haikou,Hainan 571158,China;2.Hainan Normal University/Key Laboratory of Tropical Medicinal Resource Chemistry of Ministry of Education,Haikou,Hainan 571158,China;3.Hainan University/Analytical and Testing Center,Haikou,Hainan 570228,China)Abstract Dracaena angustifolia is one of the medicinal plants of Li nationality in Hainan province.To further study the value and functions of the leaves of D.angustifolia,the study used a dimensional gel electrophoresis technology(2-DE gel)based on BPP+phenol extraction to extract and separate the proteins from the leaves of D.angustifolia and obtain the plant protein fingerprints by optimizing the experimental conditions.Image Master 5.0 software was used to analyze the gel images and screen out the highly expressed proteins;the matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS)was then used to identify these proteolytic products identified by mass spectrometry,and finally,prelimi-nary protein functional analysis was performed by bioinformatics.The results showed that there were 60 highly expressed proteins in D.angustifolia leaves,and 45 proteins were identified by biomass spectrometry,including ATP synthase,ribulose diphosphate carboxylase large chain,chloroplast,and other proteins,which are involved in the growth,development and plant stress resistance of D.angustifolia leaves.This study provides a theoretical basis for further exploitation of plant proteins in leaves of D.angustifolia but also has theoretical and practical significance for understanding the ecosystem services and eco-logical benefits of Hainan Island.Keywords leaves of Dracaena angustifolia;proteins;functional analysis 长花龙血树（Dracaena angustifolia Roxb.）属百合科（Liliaceae）龙血树属（Dracaena Vand.ex L）植物，该属植物某些物种茎部位的树脂成分是传统药物“血竭”的重要来源，而血竭是我国传统名贵中药，在我国境内发现的、有野生分布的血竭基源植物只有海南龙血树和剑叶龙血树 2 种，其性平、味甘、温、咸，具有良好的活血散淤、定痛止血、生肌敛疮等功效。海南黎族民间用长花龙血树根煮水喝，用作凉茶；叶煮水喝，治疗胃痛、腹痛1-2。现代研究表明，龙血树植物茎含有 何璇 等 海南长花龙血树叶的主要蛋白鉴定及其功能分析 -51-黄酮类、酚类、三萜及其皂苷等化学成分1，叶片含有黄酮类、阿魏酸酰胺、松脂醇、甾体等化学成分3，药理活性表现出抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗血栓、止痛止血等作用1,4；最新报道血竭在抗氧化、抑制细胞凋亡、促进神经细胞再生、辅助治疗并发症等神经退行性疾病方面的治疗潜力5。从查阅文献看，国内外对长花龙血树的研究较少且多集中在其茎中植物化学成份提取及其生物或药理活性的研究1-5，对其叶片的研究则更少，尤其是海南龙血树作为“血竭”的重要来源，其同生的叶片作为一种亟待开发研究的植物资源，值得引起广大学者的关注。本课题组的研究方向之一是海南药用植物的蛋白质组学分析，前期研究就发现，某些植物蛋白也具有一定药用功能6，可从生物大分子的角度结合其中的小分子化学成分，补充并从整体阐释药用植物的物质基础，有利于更好地实现中药现代化。基于以上多种原因，虽然有较多关于龙血树属植物化学成份提取及其生物或药理活性的研究，但还未见有长花龙血树叶的蛋白提取及其指纹图谱的建立或其中关键蛋白发现分析的报道。作为一种有良好生物及药理活性的植物药，研究其所含植物蛋白名称、发现与其药物活性相关的关键蛋白，对进一步深入开发、利用长花龙血树叶具有非常重要的实践及理论意义。基于双向电泳的蛋白质组学技术结合生物质谱分析具有分辨率高和可重复性好的特点，是目前分析蛋白质的主要工具之一6。本研究选择海南地道产长花龙血树叶作为研究对象，利用蛋白质组学技术，首次获得其蛋白指纹图谱及高表达的蛋白，并对质谱鉴定的蛋白功能进行了初步分析。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 长花龙血树叶样品 样品采集于海南省定安县白石岭公园（经度：110.323959，纬度：19.699211），经海南师范大学生命科学院的陈玉凯副教授鉴定确为长花龙血树叶。1.1.2 仪器及试剂 仪器及试剂：台式恒温振荡器（精宏）；QL-866 涡旋混合器；SIGMA3-18K低温超速离心机（德国 SIGMA）；超纯水系统（上海和泰）；EYELA 摇床（东京理化）；蛋白质等电聚 焦 仪(Ettan IPGphor3)，固 相pH 梯 胶 条（pH=3-10）；Image scanner III 扫描仪（美国通用公司 GE Healthcare）；ImageMaster5.0 凝胶图像分析软件；MultiTemp IV 恒温循环器；UV-2700 紫外分光光度计（日本岛津）；KQ2200E 型超声波清洗仪（曙峰企业）；GM-0.33A 型隔膜真空泵（津腾）；Voyager-DE PRO ABI4700 时间飞行质谱仪（美国 ABI 公司）。所有试剂均为国产分析纯试剂。所有实验用水为超纯水。1.2 方法 1.2.1 样品处理及蛋白提取 （1）样品预处理：采集回来的长花龙血树叶用超纯水把叶片清洗干净，每 4 片长花龙血树叶用锡箔纸包裹住放入保鲜袋中，于80的冰箱中保存备用。（2）蛋白提取：利用 BPP+酚提取法提取长花龙血树叶的蛋白。称量 3 g 样品于用液氮预冷的研钵中，加入 0.3 g 的 PVPP 和 0.3 g 二氧化硅粉 末 研 磨；转 移 到 10 mL 离 心 管 中，加 入10 mLBPP 提取缓冲液充分涡旋震荡 10 min；再加入 10 mLTris 饱和酚，涡旋 10 min；在 SIGMA3-18 K 低温超速离心机中离心 15 min（4，转速：16 000 g）；移取上层清液转移至干净离心管中，加入 5 mL BPP 提取缓冲液，涡旋震荡 10 min 后离心 15 min；再移取 3 mL 上清液转移至干净离心管中，加入 15 mL 预冷的 AM 沉淀剂，置于20冰箱中沉淀 12 h 以上，从冰箱中取出离心管，离心 15 min 弃去上清液；重复 2 次转移及离心步骤；风干样品（约 3 h）再加入蛋白裂解液，放置于22恒温裂解 2 h 以上；离心后转移上清液于10 mL 离心管中，放置在20冰箱中保存；采用Bradford 法测定样品的蛋白浓度6，根据文献6进行单向电泳实验，确定双向电泳的最佳上样浓度。（3）双向电泳实验：移取 285 L 蛋白溶液、160 L 蛋白裂解液和 5 L IPG Buffer 于离心管中，在 IPG 胶条（pH 47）上水化上样；保持室温 20左右，设置聚焦极限电流为每根胶条50 A，电压分别为 2