果生刺盘孢侵染苹果致病关键基因Cfcyp450的功能_陈金珠.pdf

Research paper 研究论文 22 March 2023,42(3):770-781 菌物学报 Mycosystema ISSN1672-6472 CN11-5180/Q Doi:10.13346/j.mycosystema.220204 资助项目：国家自然科学基金(32070144,32072374)；国家重点研发计划(2019YFD1002002)This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(32070144,32072374)and the National Key Research and Development Program of China(2019YFD1002002).*Corresponding author.E-mail: ORCID:CHEN Jinzhu(0000-0003-3383-6325),ZHANG Rong(0000-0001-2345-6789)Received:2022-06-03;Accepted:2022-07-04 菌物学报 Copyright 2023 Institute of Microbiology,CAS.All rights reserved.| Http:/journals- Tel:+86-10-64807521 770 果生刺盘孢侵染苹果致病关键基因 Cfcyp450 的功能 陈金珠，王静钶，刘广利，卢一鸣，梁晓飞，孙广宇，张荣*西北农林科技大学植物保护学院，陕西 杨凌 712100 摘 要：果生刺盘孢 Colletotrichum fructicola 能够引起苹果炭疽叶枯病和苹果苦腐病。前期通过基因组分析发现一个叶枯型 C.fructicola 菌株特异基因 Cfcyp450。本研究对其功能进行分析，以明确其在致病中的作用。采用同源重组方法获得了敲除突变体。表型分析显示，Cfcyp450 敲除突变体与野生型生长速率无明显差别，但敲除突变体菌落变白；与野生型相比，突变体附着胞形成降低30.02%；侵染钉延伸菌丝对玻璃纸的穿透率下降 41.19%。致病性测定显示，突变体对嘎啦叶片致病力显著下降。生物信息学分析显示，Cfcyp450 仅存在于叶枯型菌株中，同时与烟草和拟南芥内生菌同源性较高，但与刺盘孢属物种亲缘关系较远。这些结果表明果生刺盘孢 Cfcyp450 基因为叶枯型菌株的关键致病因子，可能通过水平转移获得。关键词：细胞色素 P450；豌豆素脱甲基酶；效应因子；叶枯型；基因水平转移；苦腐病 引用本文 陈金珠，王静钶，刘广利，卢一鸣，梁晓飞，孙广宇，张荣，2023.果生刺盘孢侵染苹果致病关键基因 Cfcyp450 的功能.菌物学报，42(3):770-781 Chen JZ,Wang JK,Liu GL,Lu YM,Liang XF,Sun GY,Zhang R,2023.Function of cytochrome P450 gene critical for Colletotrichum fructicola infection to apple.Mycosystema,42(3):770-781 Function of cytochrome P450 gene critical for Colletotrichum fructicola infection to apple CHEN Jinzhu,WANG Jingke,LIU Guangli,LU Yiming,LIANG Xiaofei,SUN Guangyu,ZHANG Rong*College of Plant Protection,Northwest A&F University,Yangling 712100,Shaanxi,China Abstract:Colletotrichum fructicola is the dominant pathogen of apple Glomerella leaf spot Research paper 22 March 2023,42(3):770-781 Mycosystema ISSN1672-6472 CN11-5180/Q 菌物学报 771(GLS)in China.In this study,the function of putative cytochrome P450 gene,Cfcyp450,specific in C.fructicola GLS pathotype was analyzed.Phenotypic analysis showed that deleting Cfcyp450 did not affect vegetative growth rate of C.fructicola,but the vegetative colony of the knockout mutant turned white.Compared to the wild type,appressorium formation rate reduced by 30.02%,and cellophane penetration rate reduced by 41.19%.The virulence to apple leaves was obviously decreased.Sequence analysis showed that Cfcyp450 was only found in GLS pathotype of C.fructicola and has a higher homology with cyp450 in endophytes of tobacco and Arabidopsis thaliana,but has a distant genetic relationship with cyp450 in other Colletotrichum spp.Our results reveal that the gene Cfcyp450 is the key pathogenic gene of C.fructicola,and could be obtained by horizontal gene transfer.Keywords:cytochrome P450;pea demethylase;effector;GLS pathotype;horizontal gene transfer;bitter rot 苹果炭疽叶枯病(Glomerella leaf spot,GLS)是一种危害苹果果实和叶片的毁灭性病害。该病害由刺盘孢属 Colletotrichum 多种真菌侵染引起，主要危害嘎拉系、金冠系和元帅系的品种。发生严重时导致果园大量落叶、果实丧失商品价值(Leite et al.1988；李保华等 2013)。研究表明果生刺盘孢 C.fructicola 是我国炭疽叶枯病的优势种(王薇等 2015)。果生刺盘孢是广谱植物病原菌，能侵染包括苹果在内的 50 余种寄主(Wang et al.2012；Weir et al.2012)。研究发现果生刺盘孢种内存在明显的致病性分化。在苹果上果生刺盘孢表现为两种致病型：能够侵染苹果叶片和果实引起炭疽叶枯病的叶枯型和仅侵染苹果果实引起苹果果实炭疽病，即苦腐病的苦腐型(Fu et al.2013；Velho et al.2015；王薇等 2015；Rockenbach et al.2016)。苦腐型和叶枯型菌株形成的原因尚不清楚。果生刺盘孢基因组中存在大量候选效应蛋白、毒素、次级代谢物合成酶和转运子等毒性相关基因(Liang et al.2018)。本研究室前期通过苦腐型和叶枯型菌株比较基因组分析发现一个叶枯型 C.fructicola 菌株特异基因 Cfcyp450。本研究通过基因敲除技术构建敲除突变体并分析突变体在营养生长、发育及致病性的差异，发现Cfcyp450 为叶枯型菌株关键致病基因。该研究将对揭示果生刺盘孢致病机制及叶枯型菌株形成机制提供新证据。1 材料与方法材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 菌株和果实品种 果生刺盘孢 Colletotrichum fructicola Prihast.,L.Cai&K.D.Hyde 野生叶枯型菌株 1104-6 由西北农林科技大学真菌实验室保存。大肠杆菌Escherichia coli DH5 购买自上海唯地生物科技有限公司。健康嘎啦品种苹果叶片和果实，采摘于陕西杨凌黎张沟苹果园。1.1.2 试剂 Taq DNA 聚合酶(TransGen Biotech)、Pfu DNA 聚合酶(TransGen Biotech)、定量 Mix(Genstar)、限制性内切酶(TaKaRa)、原生质体转化试剂(Sigma-ALDRICH 公司)、潮霉素(Coolaber)等。1.2 Cfcyp450 的克隆和生物信息学分析 从果生刺盘孢 C.fructicola1104-6 基因组中获得 Cfcyp450基因核苷酸序列，利用 Premier 5.0软件设计引物。引物(表 1)合成和测序工作均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。根据结构域在线网站(SMART)对 Cfcyp450 蛋白氨基酸序列进行检索。使用软件 DNAMAN 进行序列比对，MEGA11.0 构建系统发育树。陈金珠 等/果生刺盘孢侵染苹果致病关键基因Cfcyp450的功能 研究论文 菌物学报 772 1.3 Cfcyp450 基因敲除盒构建及转化子验证 利用 CTAB 法提取 1104-6 菌株的 DNA。以其为模板，分别用引物 Cfcyp450-LF+Cfcyp450-LR 和 Cfcyp450-RF+Cfcyp450-RR 扩增出编码区上、下游各 1.2 kb 的片段 L1 和 R1。以潮霉素质粒 pGemT 为模板，用 HyRNest/NHFGHSF 和Nygf/NHYGHSR 引物扩增潮霉素磷酸转移酶的分片段 HP 和 PT。以上、下游两个片段和分片段为模板，加入巢式引物融合 PCR 扩增出Cfcyp450 基因敲除的两个片段。制备原生质体(韩小路等 2016)，加入 Cfcyp450基因的两条重组片段，进行遗传转化，抗性筛选标记为潮霉素，挑取转化子并提取野生型和转化子DNA。以转化子 DNA 为模板用基因内部引物Cfcyp450-DF/Cfcyp450-DR 检测 Cfcyp450 基因。Cfcyp450-LF/Xu855R 检测 Cfcyp450 基因上游的同源重组事件。Cfcyp450-RR/Xu866F 检测 Cfcyp450基因下游的同源重组事件(表 1)。HY/YG 用来检测分片段间同源重组的发生和 hph 基因的存在(王光辉 2010)。1.4 Cfcyp450 基因敲除突变体回补菌株的获得 为了得到 Cfcyp450 突变体的回补菌株，设计引物 PYF3-eGFP-Cfcyp450Spe1F 和 PYF3-eGFP-Cfcyp450BamH1R(表 1)，从野生型 1104-6的 cDNA 中扩增得到不含终止密码子的 Cfcyp450基因。回收 PCR 产物，以质粒 PYF3-eGFP 为载体，通过大肠杆菌的连接转化构建 Cfcyp450 基因回复载体。将回复载体转入敲除突变体，筛选抗生素为 G418。表 1 本研究涉及的引物序列 Table 1 Sequences of primers used in this study 引物名称 Primer name 引物序列 Primer sequence(53)Cfcyp450-LF GGAACAGCCCAAGAGAGACC Cfcyp450-LR CGTCAGATCGATGGTAGTTGTCGTCGACTGTTCGCTCGAGGACTCAGAC Cfcyp450-RF TG