基于HPLC-Q-Exac...小儿解感颗粒定性与定量分析_李君.pdf

基金项目内蒙古自治区自然科学基金（编号：）；内蒙古自治区卫生健康委医疗卫生科技计划项目（编号：）；内蒙古自治区高等学校科学研究项目（编号：）；内蒙古医科大学面上项目（编号：）作者简介李君，男，硕士，助理研究员，研究方向：中蒙药药效物质研究 通信作者周旻昱，女，本科，副主任药师，研究方向：医院药事管理学基于 和 技术的小儿解感颗粒定性与定量分析李君，王跃武，张谦，张微，胡玉霞，张梦迪，白图雅，周旻昱（内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 ；内蒙古自治区新药筛选工程研究中心，内蒙古 呼和浩特 ；内蒙古医科大学附属医院药学部，内蒙古 呼和浩特 ）摘要目的：建立小儿解感颗粒化学成分快速鉴定及定量分析方法。方法：定性分析采用 色谱柱（，），流动相为甲醇（）甲酸水（），流速为 ，柱温 ，进样量，质谱采用正、负离子扫描，扫描范围 。定量分析采用 色谱柱（，），流动相为甲醇（）甲酸水（），流速 ，柱温，进样量为，多反应监测（）正、负离子切换监测模式。结果：在小儿解感颗粒中鉴别出 个成分，包括 个黄酮类、个三萜类、个有机酸类、个脂肪酸类和个氨基酸类成分；定量分析结果显示，柴胡皂苷、黄芩苷、柴胡皂苷、黄芩素、芦丁、甘草苷在线性范围内呈良好的线性关系（），加样回收率范围在 。批解感颗粒中个成分的质量分数范围分别为 ，。结论：该方法稳定、可靠，可用于小儿解感颗粒的质量控制。关键词小儿解感颗粒；高效液相色谱四级杆静电场轨道阱高分辨质谱；高效液相色谱串联三重四级杆质谱；定性分析；定量分析 中图分类号 ；文献标识码 文章编号 （）：，（，；，；，）：（，）（）（），（）（，），（）（），（），（），：；中国医院药学杂志 年月第 卷第期 ，小儿解感颗粒由柴胡、黄芩、甘草、荆芥、桔梗及大青叶味传统中药组成，方中柴胡辛散苦泄，微寒退热，善于祛邪解表退热，为君药；黄芩苦寒，主入肺经，善清泄肺火及上焦实热，为臣药；荆芥辛散微温，疏风散邪，大青叶苦寒，清热解毒，桔梗苦辛平，宣肺利咽、祛痰，三者共用为佐药；甘草调和诸药，为使药，六药配伍共奏清热解毒、消炎止咳之功效，临床 用 于 儿 童 感 冒 发 烧、咽 喉 肿 痛 等 症 的 治疗。现代药理学研究表明，方中君药柴胡所含三萜类成分柴胡皂苷、柴胡皂苷具有解热、镇痛等作用；黄芩素、黄芩苷作为臣药黄芩中的特征性成分，具有抗炎、抗病毒等药理活性；甘草所含黄酮类成分甘草苷具有止咳平喘等功效；芦丁作为一种广泛存在多种药用植物中的天然黄酮类成分，其在抗氧化方面作用显著。目前，小儿解感颗粒在质量控制方面的研究多以方中单一成分或某味药材中几个成分为指标，未见针对方中多味药材中多指标成分的质量评价模式，因此选择柴胡皂苷、柴胡皂苷、黄芩素、黄芩苷、甘草苷、芦丁个与小儿解感颗粒临床功效相关的成分进行多指标的定量分析，对保证制剂质量的可控性和疗效的稳定性具有重要意义；同时，由于复方制剂药效的发挥具有“多成分、多途径、多靶点”作用特点，其复杂的化学组成与药效之间的关联性备受学者们的关注，因此，对其复杂的化学组成进行全面表征将为其药效物质挖掘奠定一定的基础。本研究采用高分辨液质联用技术，通过谱库检索、质谱识别及标准品比对的分析流程，对小儿解感颗粒中的复杂化学组成进行辨识分析；同时，采用 技术，通过多反应监测模式，对小儿解感颗粒中个成分（甘草苷、柴胡皂苷、柴胡皂苷、黄芩苷、黄芩素、芦丁）进行同时定量分析，旨在通过对小儿解感颗粒的快速定性定量分析，为其药效物质解析、质量标准研究提供数据支撑。材料 仪器 型高效液相色谱质谱联用系统仪 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；型三重四极杆液质联用仪（日本 公司）；型十万分之一电子天平（日本 公司）；型数控超声波清洗器（上海生析超声仪器有限公司）。试 药黄 芩 苷（批 号 ，纯 度 ）、黄芩素（批号 ，纯度 ）、柴胡皂苷（批号 ，纯度 ）、柴胡皂苷（批号 ，纯度 ）、甘草苷（批号 ，纯 度 ）、甘 草 酸（批 号 ，纯度 ）对照品购自成都普思生物科技有限公司；芦丁（批号 ，纯度 ）、绿 原 酸（批 号 ，纯 度 ）、槲 皮 素（批 号 ，纯 度 ）对照品均购自中国食品药品检定研究院；木犀草素（批号 ，纯度 ）对照品购自成都德思特生物科技有限公司；甲醇、乙腈均为色谱纯，甲酸、乙酸铵均为分析纯，水为屈臣氏 蒸 馏 水。小 儿 解 感 颗 粒（批 号 、）购自山东明仁福瑞达制药股份有限公司。方法与结果 溶液的制备 定性用对照品溶液精密称取柴胡皂苷、黄芩苷、柴胡皂苷、黄芩素、芦丁、甘草苷、槲皮素、木犀草素、甘草酸、绿原酸 个对照品各适量，分别置于不同的 量瓶中，加甲醇溶解、定容，制成单一 对 照 品 储 备 液，质 量 浓 度 分 别 为 ，分别精密量取上述各贮备液 于同一 量瓶中，加甲醇稀释，得质量浓度分别为 ，的混合对照品溶液，将其置于保存，备用。定量用对照品溶液精密称取柴胡皂苷、黄芩苷、柴胡皂苷、黄芩素、芦丁、甘草苷个对照品各适量，分别置于不同 量瓶中，加甲醇溶解、定容，制成单一对照品储备液，质量浓度分别为 ，分别精密量取上述各贮备液适量置于同一 量瓶中，加甲醇稀释，得质量浓度分别为 ，的混合对照品溶液，将其置于保存，备用。供 试 品 溶 液取 小 儿 解 感 颗 粒（批 号 ），研磨，过 目筛，精密称取 至 量瓶中，加入适量甲醇，超声提取 （功率 ，频率 ），冷却至室温，甲醇补足至刻度，摇匀，经 滤膜过滤，即得。阴性对照溶液在不加入小儿解感颗粒前提下，按“”项下供试品溶液制备方法处理并制备阴性对照溶液。定性分析 色谱质谱条件色谱柱为 中国医院药学杂志 年月第 卷第期 ，（，），流动相为甲醇（）甲酸水溶液（），梯度洗脱（，；，；，；，；，；，；，），流 速 为 ，柱温为 ，进样量为。采用电喷雾离子源（），在 、离子检测模式下检测，检测方式为 ，分辨率为 ，分辨率为 ，扫描范围为 ，碰撞 能 量设 置为 ，喷 雾 电 压：（）和 （），离 子 传 输 管 温 度 （）和 （），辅助气温度 ，辅助气体积流量 。数据库建立与分析利用中医药系统药理学数据库分析平台、中国知网、万方等数据库，收集小儿解感颗粒组方中柴胡、甘草、黄芩等各药材的化学成分及质谱碎片信息并汇总，创建包括成分名称、分子式、理论相对分子质量、多级质谱碎片等信息的本地数据库；在此基础上，采用 软件对小儿解感颗粒供试品溶液和混合对照品溶液在正、负离子模式下获得总离子流数据进行峰提取并拟合精确相对分子质量，通过与本地数据库进行比对，以实际测定相对分子质量与理论相对分子质量偏差在 以内为原则初步对小儿解感颗粒中成分进行指认，以各成分多级质谱碎片对其做进一步确认，最终鉴定小儿解感颗粒中化学成分。解感颗粒化学成分鉴定取“”项下供试品溶液，按“”项下色谱质谱条件进样分析，按“”项下分析方法对供试品所含化学成分进行辨识分析，结果共鉴定出 个化合物，包括 个黄酮类成分，个三萜类成分，个有机酸类成分，个氨基酸类成分，个脂肪酸类成分。其中有 个成分通过与对照品比对得到进一步确证，结果见表。表小儿解感颗粒化学成分的 鉴定结果 名称保留时间 分子式离子模式分子离子峰理论值实测值误差（）碎片类型 精氨酸 氨基酸类 奎宁酸 ，有机酸类 脯氨酸 ，氨基酸类 酪氨酸 ，氨基酸类 柠檬酸 ，有机酸类 没食子酸 ，有机酸类 原儿茶酸 ，有机酸类 绿原酸 ，有机酸类 隐绿原酸 ，有机酸类 槲皮素，黄酮类 阿魏酸，有机酸类 夏佛塔苷 ，黄酮类 水仙苷 黄酮类 红 花 素葡 萄 糖醛酸苷 ，黄酮类 甘草苷 ，黄酮类 佛莱心苷 ，黄酮类 芹糖甘草苷 ，黄酮类 白杨 素阿 拉 伯糖葡萄糖苷 ，黄酮类 鞣花酸 黄酮类 牡荆素 ，黄酮类 羟基马鞭草苷 黄酮类 木犀草苷 ，黄酮类 芦丁，黄酮类 红花素 黄酮类 甘草素 ，黄酮类 马鞭草苷 黄酮类中国医院药学杂志 年月第 卷第期 ，续表名称保留时间 分子式离子模式分子离子峰理论值实测值误差（）碎片类型 异甘草苷 ，黄酮类 甘草查尔酮 ，黄酮类 野黄芩苷 ，黄酮类 木犀草素 ，黄酮类 异鼠李素 ，黄酮类 黄芩苷 ，黄酮类 异甘草素 ，黄酮类 高车前素 ，黄酮类 黄芩素 ，黄酮类 刺芒柄花素 ，黄酮类 黄芩黄酮 ，黄酮类 黄芩黄酮 ，黄酮类 甘草酚 ，黄酮类 汉黄芩素 ，黄酮类 白杨素 ，黄酮类 二 羟 基 二 甲 氧 基黄酮 ，黄酮类 甘草皂苷 ，三萜类 甘草黄酮醇 ，黄酮类 鳞叶甘草素 黄酮类 甘草皂苷 ，三萜类 靛蓝 ，黄酮类 甘草查尔酮 ，黄酮类 甘草宁 黄酮类 鳞叶甘草素 ，黄酮类 光甘草酮 黄酮类 柴胡皂苷，三萜类 甘草酸 ，三萜类 柴胡皂苷，三萜类 柴胡皂苷 ，三萜类 甘草宁 黄酮类 柴胡皂苷，三萜类 甘草次酸 三萜类 亚麻酸 ，脂肪酸类 齐墩果酸 三萜类 亚油酸 ，脂肪酸类 棕榈酸 脂肪酸类 油酸 脂肪酸类注（）：为对照品比对（）。黄酮类成分的解析 个黄酮类化合物在小儿解感颗粒中被鉴定，此类化合物的裂解过程以木犀草素（化合物）为例进行说明：号化合物在 模 式 下 可 见 准 分 子 离 子 峰 ，软 件 拟 合 其 分 子 式 为 ，主要碎片离子峰为 、，即准分子离子峰发生逆 狄 尔 斯阿 德 尔 反 应（）反 应 产 生 和 ，碎片离子峰进一步丢失分子 产生 ，通过化合物裂解规律、文献信息及对照品比对，确认 号化合物为木犀草素。化合物 的 图及可能的裂解途径见图。三萜类成分的解析个三萜类化合物在小儿解感颗粒中被鉴定出来，此类化合物的裂解过程以甘草酸（化合物）为例进行说明：号化合物在 模式下可见 的准分子离子峰，软件拟合其分子式为 ，主要 二 级 碎 片 离 子 峰 为 、，即准分子 离 子 峰 失 去 分 子 和 产 生中国医院药学杂志 年月第 卷第期 ，碎片离子峰，或失去分子葡萄糖基团产生 碎片离 子 峰，或 失 去 分 子 葡 萄 糖 基 团 产 生 碎片离子峰，结合化合物裂解规律、文献信息 ，及对照品比对信息，确认 号化合物为甘草酸，化合物 的 图及可能的裂解途径见图。有机酸类成分的解析个有机酸类化合物在小儿解感颗粒中被鉴定，此类化合物的裂解过程以奎宁酸（化合物）为例进行说明：号化合物在 模式下可见 的准分子离子峰，软件拟合其分子式为，主要 二 级 碎 片 离 子 峰 为 、，即准分子离子峰失去分子 产生 碎片离子峰，进一步失去分子 和 产生 碎片离子峰，结合化合物裂解特征、文献信息，确认号化合物为奎宁酸，号化合物的 图及可能的裂解途径见图。脂肪酸类及氨基酸类成分的解析个脂肪酸类化合物在小儿解感颗粒中被鉴定，此类化合物的裂解过程以亚油酸（化合物）为例进行说明：号 化 合 物 在 模 式 下 可 见 的准分子离子峰，软件拟合其分子式 为 ，主 要 二 级 碎 片 离 子 峰 为 ，即准分子离子峰失去分子 产生 碎片离子峰，结合化合物裂解特征、文献信息，确认 号化合物为亚油酸，号化合物的 图及可能的裂解途径见图。个氨基酸类化合物在小儿解感颗粒中被鉴定，此类化合物的裂解过程以酪氨酸（化合物）为例进行说明：化合物 在 模式下可见 的准分子离子峰，软件 拟合其分子式为，主要二级碎片离子图化合物 的 图及可能的裂解途径 图化合物 的 图及可能的裂解途径 中国医院药学杂志 年月第 卷第期 ，图化合物的 图及可能的裂解途径 图化合物 的 图及可能的裂解途径 峰为 、，即准分子离子峰失去分子 产生 碎片离子峰，继续丢失分子产 生 碎片离子峰，结合化合物裂解特征、文献信息，确认号化合物为酪氨酸，号化合物的图及可能的裂解途径见图。定量分析 色 谱质 谱 条 件色 谱 柱 为 （，），流动相为甲醇（）甲酸水溶液（），流速为 ，柱 温 为 ，进 样 量 为；梯 度 洗 脱（，；，；，；，；，；，；，）。采用电喷雾离子源（），、切换模式，多重反应监测（）扫描方式，雾化气流量为 ，加热气流量为 ，脱溶剂温度为 。专属性试验采用 定量模式，个待测成分的质谱分析条件参数见表，混合对照品溶液、小儿解感颗粒供试品溶液及阴性对照溶液在“”项下色谱质谱条件下分析得到