基于BSA-seq技术定位绿豆种皮颜色基因_黄琬婷.pdf

DOI：10.13430/ki.jpgr.20221025005植物遗传资源学报 2023，24（3）：790-800Journal of Plant Genetic Resources基于BSA-seq技术定位绿豆种皮颜色基因黄琬婷，王茜，张泽燕，朱慧珺，闫虎斌，张耀文（山西农业大学农学院，太原 030031）摘要：种皮颜色是作物重要的驯化性状和形态标记，绿豆种皮颜色与黄酮类化合物含量有关。挖掘绿豆种皮颜色相关基因有助于开发新品种，提高绿豆种皮的应用价值。本研究以冀绿9号（黑色种皮）和资源330（黄色种皮）为亲本构建F2分离群体，采用BSA-seq方法进行定位。结果表明，SNPs和InDels关联区域交集位于4号染色体共3.26 Mb的区段，包含324个基因，其中非同义突变基因共49个，移码突变基因15个。进一步开发KASP分子标记进行精细定位，筛选出高质量KASP引物11对。最终将绿豆种皮色位点定位于4号染色体上的KA330KA421之间，物理距离为16、302、33018、013、421 bp（1.71 Mb）。结合转录组数据分析和qRT-PCR表达分析共筛选出6个候选基因，其中LOC106758748基因注释为MYB90，其功能为参与调控黄酮类化合物生物合成，故可能是调控绿豆种皮颜色的关键基因。本研究结果可为绿豆种皮色相关基因的克隆和在育种中的利用提供一定的理论依据。关键词：绿豆；种皮颜色；基因定位；BSA-seqMapping of Seed Coat Color Related Genes by BSA-seq in Mung Bean（Vigna radiata L.）HUANG Wan-ting，WANG Qian，ZHANG Ze-yan，ZHU Hui-jun，YAN Hu-bin，ZHANG Yao-wen（College of Agronomy，Shanxi Agricultural University，Taiyuan 030031）Abstract：Seed coat color is an important agronomic trait that associates with crop domestication and serves as morphological marker.In mung bean，the seed coat color was related to the content of flavonoids.Cloning and application of seed coat color-related genes becomes of interest in development of new mung bean varieties with improved nutritional properties.In this study，the varieties Jilv 9（black seed coat）and Ziyuan 330（yellow seed coat）were used as parents to generate an F2 segregating population.The BSA-seq approach was applied for mapping of the genes underlying the seed coat color.The association analysis using integrated SNPs and InDels suggested an interval of 3.26 Mb harboring 324 predicted genes，of which 49 genes were found with non-synonymous mutation and 15 genes were detected with frameshift mutation.By further use of 11 high-quality KASP markers in fine mapping，the candidate interval was finally delimited between KA330 and KA421 in the physical interval of 16，302，330-18，013，421 bp（1.71 Mb）on chromosome 4.The transcriptome data analysis and qRT-PCR expression analysis suggested six differently-expressed candidate genes，of which the LOC106758748 was annotated as a transcription factor MYB90 that was reported with a function in the flavonoid biosynthesis and served as key candidate gene regulating the seed coat color in mung bean.The results of this study can provide a theoretical basis for the cloning and utilization of the genes related to seed coat color in mung bean seed breeding.Key words：mung bean；the color of seed coat；mapping；BSA-seq收稿日期：2022-10-25 修回日期：2022-11-15 网络出版日期：2022-12-09URL：https：/doi.org/10.13430/ki.jpgr.20221025005第一作者研究方向为绿豆分子遗传育种，E-mail：通信作者：张耀文，研究方向为食用豆育种及栽培技术研究，E-mail：基金项目：山西省基础研究计划项目（20210302124504）；山西农业大学博士科研启动项目（2021BQ43）；山西省博士毕业生、博士后研究人员来晋工作奖励资金科研项目（SXBYKY2021050）；山西省农业科学院作物科学研究所博士基金计划（ZB1101）Foundation projects：Shanxi Basic Research Program Project（20210302124504）；The Ph.D.of Shanxi Agricultural University Scientific Research Start-up Project（2021BQ43）；The Shanxi Province Doctoral Graduates，Postdoctoral Researchers Come to Shanxi Province to Work Incentive Fund Scientific Research Project（SXBYKY2021050）；The Shanxi Academy of Agricultural Sciences Institute of Crop Science Doctoral Fund Program（ZB1101）3 期黄琬婷等：基于BSA-seq技术定位绿豆种皮颜色基因种皮由珠被（母本）发育而来，指被覆于种子周围的皮，可以保护种子的内部不受伤害。种皮中含有丰富的化合物，如黄酮、蛋白质和多肽等。研究表明，不同颜色的种皮中黄酮类化合物含量不同1。黄酮类化合物是指2个苯环通过3个碳原子相互连接而成的一系列化合物的总称，其中包括黄酮醇、花青素和原花青素等，在作物种皮中广泛分布2。作为亚洲最重要的豆类之一，绿豆种皮也富含黄酮类物质，并被广泛应用于功能食品和保健药物研发3。深入研究绿豆种皮颜色的调控机理，可为今后功能性品种选育和开发利用奠定理论基础。迄今为止，国内外研究人员对作物种皮颜色均已开展了较为频繁的研究。赵钰涵等4利用二代SNP芯片结合BSA方法对花生黑种皮基因进行了定位，在10号染色体70109 Mb区间内筛选到一个与黑种皮性状紧密连锁的SSR标记pTsaSSR107.16；Herniter等5研究表明一个或多个MYB113的变异可能影响黑色素的合成，并认为Vigun05g039500可控制豇豆种皮的黑色素合成；Garca-Fernndez等6认为白色菜豆种皮与非白色菜豆种皮分离比为1 1，由单基因控制；而棕色种皮与黑色种皮分离比为3 1，由两个上位性相互作用的基因控制，并进一步将白色种皮基因定位在7号染色体，黑色种皮基因则分别定位在6号和8号染色体。Zhang等7则发现花生红种皮受单隐性基因AhRt2控制，并应用BSA-seq、功能注释、表达质谱和序列变异等分析确定Arahy.IK60LM为花生红种皮的候选基因。随着高通量全基因组测序技术的发展，基于深度测序的批量分离分析（BSA，bulked segant analysis）从基因组中检测 SNP 和 InDel 可快速发掘候选基因，并已在大豆8、向日葵9、油菜10等物种中广泛应用，也被用于绿豆抗病虫基因的挖掘11-12。作为小宗作物，虽然全基因组序列已经公布13，但相关的分子遗传学及基因组学研究相对滞后。本研究利用冀绿9号（黑色种皮）和资源330（黄色种皮）杂交的F2分离群体，构建了2个种皮色基因混池。根据BSA-seq全基因组重测序结果，初步筛选出调控绿豆种皮颜色的候选区域，在候选区域内设计KASP分子标记进行精细定位，并结合不同时期种皮转录组分析结果、GO、KEGG富集分析，进一步筛选出调控绿豆种皮颜色的候选基因。研究结果对加快分子标记辅助选择育种及进一步阐明绿豆种皮颜色调控机制具有一定的意义。1材料与方法1.1材料及表型观测本研究使用的母本材料为冀绿9号，是河北农业科学院优质品种，种皮黑色，结荚一致，不炸荚，抗倒性强；父本材料为资源330，是山西沁县农家品种，种皮黄色。2019年6月利用冀绿9号和资源330配置组合，同年8月底收获杂交F1并统计表型数据。2020年5月将亲本和杂交荚同时种植，收获F2脱粒后晒干备用，统计表型数据。2021年5月将亲本及F2分离群体527株（后期23株花落未结荚）种植在山西省晋中市山西农业大学东阳试验基地，小区长5 m，宽2 m，4行种植，每行20株，共种植10个小区，种子成熟后统计表型数据，进行卡方检验。1.2试验方法1.2.1混池测序选取后代极端黑色种皮和黄色种皮绿豆各30株，取相对应植株顶端幼嫩叶片12片，称取12 g，采用改良的CTAB法14提取DNA，制备 DNA 3 g，样品浓度 20 ng/L。将黑色种皮30份DNA和黄色种皮30份DNA分别等量混合，构建2个后代极端混池，送北京百迈克生物科技有限公司质检合格后用超声破碎将DNA随机打断成350 bp的片段，并经末端修复、加测序接头、纯化、PCR扩增等，完成测序文库构建。文库质检合格后通过Illumina HiSeq上机测序。1.2.2测序数据分析为了保证信息分析质量，原始测序序列依次通过以下步骤的筛选：（1）对原始序列过滤15，去除带接头（Adapter）的Reads；（2）若一条Reads上N（未能确定出具体的碱基类型）的比例大于10%，过滤掉该Pair end reads；（3）去除低质量Reads（质量值Q10的碱基数占整条read的50%以上）。质量合格后，将二代高通量测序得到的短序列与参考基因组比对，通过比对定位Clean Reads在参考基因组上的位置，统计各样品的测序深度、基因组覆盖度等信息，并做变异检测。1.2.3SNP和InDel的检测和分析SNP检测主要使用GATK16软件工具包实现。根据Clean Reads在