基于DNA条形码、多重PC...对九香虫及其混伪品进行鉴定_王孟虎.pdf

九香虫为蝽科昆虫九香虫Aspongopus chi-nensis Dallas的干燥体1，其药用历史悠久，是一种药用价值较高、营养价值较高的昆虫类中草药和保健食品2，具有抗菌3、抗癌4、镇痛5、抗氧化6及改善生殖器官7的作用。已报道的九香虫化合物包括脂肪酸、蛋白质、氨基酸、臭气类、核苷类、多巴胺类化合物及其他营养成分。九香虫体内脂肪酸类化合物最多，包括油酸、亚油酸、软酸、软亚油酸、硬亚油酸等8。由此可见，九香虫脂肪油主要是不饱和脂肪酸，占70%以上。另外九香虫还富含维生素、微量元素、磷脂、蛋白质及氨基酸，维生素中含有的维生素A及维生素C的含量较高。市售九香虫常见的混伪品是小皱蝽，小皱蝽除略小于九香虫外，其他形态特征与其相似，小皱蝽常冒充小的九香虫进行销售，若两者进行掺杂，极难鉴别。黄秋强等9人借助生物显微镜及扫描电镜对九香虫、小皱蝽进行鉴别，发现两者的区别主要在腹背板。鞠康等10人对九香虫及其混淆品微性状鉴别研究，发现在头部、前胸背板、小盾片、腹侧缘、前翅、生殖节等方面均有较明显的区别。李莎等人11,12发现九香虫及其混伪品药材性状和显微鉴别可以通过腹背板进行鉴别；通过DNA条形码技术和九香虫的线粒体基因测序技术能够准确鉴定九香虫及其混伪品。传统鉴定方法可以通过性状、显微进行鉴定，但其无法对掺杂一定比例的九香虫药材准确鉴定掺杂基原。多重PCR技术是基于每个物种基因设计特异性引物，基于特异性引物扩增的产物碱基长基于 DNA 条形码、多重 PCR、荧光定量 PCR对九香虫及其混伪品进行鉴定王孟虎1,2，孙一帆3，左亚锋1，孟祥松1，栗进才1，俞浩1，许亮2，康廷国2（1.亳州学院，安徽亳州236800；2.辽宁中医药大学，辽宁大连116600；3.亳州职业技术学院，安徽亳州236800）收稿日期：2022-10-23通讯作者：许亮（1978-），男，辽宁沈阳人，博士，教授。研究方向：中药鉴定与品质评价。基金项目：辽宁省“百千万人才工程”资助项目；安徽高校自然科学研究项目（KJ2021A1143；KJ2020A0765）；亳州学院科研项目（BYZ2017C02；BYZXKTD202004；BYH202108）；高校学科（专业）拔尖人才（gxbjZD2020095）摘要：目的：基于DNA条形码、多重PCR、荧光定量PCR对市售九香虫、小皱蝽及其掺杂样品进行鉴定。方法：利用通用引物COI进行扩增并测序，构建NJ系统发育树、二级结构并计算种内种间遗传距离；基于COI序列设计九香虫、小皱蝽特异性引物并进行电泳，比较电泳条带；基于COI引物进行SBYR荧光定量PCR，观察单一样品及不同比例混合样品的熔解曲线及其Tm值。结果：利用MEGA 11.0软件分析显示九香虫、小皱蝽分别单独聚为一支，其种间遗传距离均大于0.22，种内遗传距离均小于0.02；两者的二级结构在整体框架具有明显不同。基于特异性引物扩增的九香虫、小皱蝽均出现单一条带，不同比例的混合样品与混合引物进行扩增均出现2条条带。基于COI引物扩增的九香虫、小皱蝽熔解曲线Tm值分别为75、89，不同比例混合样品的熔解曲线Tm值分别在75.00、89.00出现两个峰值。结论：DNA条形码能够及二级结构准确鉴定九香虫、小皱蝽；多重PCR及基于SBYR荧光定量PCR不仅能够准确对单一九香虫、小皱蝽进行鉴定，也能够对不同比例的混合样品进行准确鉴定。关键词：DNA条形码；多重PCR；荧光定量PCR；二级结构；九香虫中图分类号：R932文献标识码：A文章编号：1673-260X（2023）02-0060-06Vol.39 No.2Feb.2023赤 峰 学 院 学 报（自 然 科 学 版）Journal of Chifeng University(Natural Science Edition)第39卷第2期2023年2月60-DOI:10.13398/ki.issn1673-260 x.2023.02.009度不同，进行电泳后其条带位置不同，进而对物种进行准确鉴定。利用SBYR荧光定量PCR进行扩增，其熔解曲线与碱基长度及碱基组成比例有关，设计的特异性引物扩增的产物碱基组成及长度不同，其熔解曲线亦不相同，根据熔解曲线Tm值不同进行对物种进行鉴定13。1材料与试剂1.1材料从康美市场购买九香虫正品5批次、小皱蝽5批次，九香虫标记分别为JXC-01?JXC-05，小皱蝽标记分别为XZC-01?XZC-05。所有样品均经孟祥松主任中药师鉴定，所有样品储存均存放在亳州学院冷库内。1.2仪器与试剂实时荧光定量PCR（伯乐，CFX Connect）,PCR仪（伯乐，T100）、低温冷冻研磨仪（上海净信，JX-CL）、全自动数码凝胶成像分析仪（上海培清，JS-2000）、JOANLAB多功能混匀仪（群安实验仪器、VN-500Pro）、IKA漩涡混合器（艾卡，Vortex-1）、移液枪（赛默飞世尔)（ThermoFisherF3）、电泳仪（北京六一，EPS300)、粉碎机（美的，MJ-FP12X2-100）、Ezup柱式动物基因组DNA提取试剂盒（生工，FC09KA4055）、DNA分 子 量 标 准Marker（2000bp)（生工、B500350-0500）、SYBRGreen染料Mix（生工，I308KA3871）、4SGelRed（BBI，A616697-0500）、2TaqMasterMix（诺唯赞，7E341F9）、TAE（50）（biosharp，691176248）、琼 脂 糖（恒 奥 生 物，EZ6688C178）。2方法2.1DNA提取取九香虫、小皱蝽适量，用粉碎机粉碎，称量粉末约30mg加入1.5mL离心管中，并向其中加入180uL的Buffer ACL及研磨珠，在低温冷冻研磨仪研磨1min（60次/秒），低速离心去除泡沫，剩余操作均与Ezup柱式动物基因组DNA提取试剂盒说明书相同，提取的DNA放置在-20冰箱内储存备用。2.2PCR扩增体系及反应条件COI序列扩增正反引物详见表1。PCR扩增体系为50L，含有正反向引物各2.0L（2.5mol/L），稳 定 剂 和 溴 酚 蓝 燃 料（TaqMasterMix）25L，总DNA4.0L（约40ng），加去RNA酶水17L。扩增程序为94预变性5min；94变性1min，55退火1min，72延 伸1.5min（35个 循 环）；72延 伸5min。2.3电泳检测DNA质量使用2.0%的琼脂糖凝胶液倒入电泳槽中，静置30min，用移液枪吸取PCR扩增产物5.0L、Marker 2.0L，在120V电压下电泳25min，取出放置凝胶成像系统中分析，与Marker比较后无杂带并且清晰时拍照保存图像。2.4测序扩增成功的PCR产物委托上海生工进行测序，测序产物为PCR反应物，测序前PCR扩增产物经纯化再进行双向测序，获得双向测序原始序列碱基及峰图。2.5数据处理测序所得的原始序列利用CodonCode Aligner17.0软件进行查看、拼接校对，去除低质量的序列及引物区，以碱基质量不低于20为标准。将测得的COI序列用软件MEGA11.0比对分析，去除多余的碱基。基于K2P模型进行种间变异位点和遗传距离分析，基于COI序列构建二级结构及系统聚类树，利用bootstrap（1000次重复）检验各分支的支持率。2.6特异性引物设计根据所测的COI基因序列，利用软件MEGA11.0比对找到变异位点，利用Oligo 7.0软件手动设计特异性引物并在NCBI上进行引物Blast分析，确保设计的引物对九香虫、小皱蝽均具有特异性，且其PCR扩增长度不同，设计的引物详见表1。2.7多重PCR扩增将特异性引物分别与对应的模板进行扩增，扩增成功后进行电泳，观察扩增产物电泳条带位置。将九香虫、小皱蝽DNA按1：1、3:1、6:1、9:1混合，加入混合引物和单一引物进行扩增，将扩增产物电泳，观察电泳条带位置。2.8多重荧光定量PCR15多重荧光定量PCR扩增程序为：95 3min；95 15s，58 30s，72 15s，45cycles；熔解曲线医学心理学61-引物序号物种名称引物序列产物长度JXC-F九香虫GAGCTGGATGGTGGGTATAG473bpJXC-RATGGTGTTCGTTCAGGGGTTXZC-F小皱蝽GCCTCACACTTGCAGCCTAT255bpXZC-RAGAAGTCTGTGATGTCGGGGCOI-F通用引物GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG555bpCOI-RTAAAC-TTCAGGGTGACCAAAAAATCA表1九香虫、小皱蝽特异性引物及通用引物程序为：95 1min；58 30s，0.5/min，升温至95。PCR反应体系为SYBR Green Mix 12.5L，正反引物各1L，模板2L，加双蒸水至25L。将特异性引物、模板、SBYR染料等混合后分别进行扩增，记录其扩增产物的熔解曲线Tm值。将九香虫、小皱蝽DNA按1：1、3:1、6:1、9:1混合，分别加入混合引物进行扩增，记录其熔解曲线Tm值。3结果3.1DNA扩增检测基于COI引物进行普通PCR扩增，产物并分别进行电泳，电泳条带清晰，表明DNA提取及扩增成功。基于COI引物进行荧光定量PCR扩增，扩增产物进行熔解曲线分析，其熔解曲线峰为单峰，说明PCR扩增成功，详见图1。3.2种内、种间遗传距离分析将拼接、去引物的COI碱基序列利用MEGA11.0软件进行比对，长度为555bp。九香虫种内遗传距离为0.000.004，小皱蝽种内遗传距离为0.000.009，种间遗传距离为0.2250.233，具体详见表2。九香虫与小皱蝽种间碱基不同位点有106个，九香虫种内碱基变异位点有2个，小皱蝽种内碱基变异位点有6个。由表可知，九香虫、小皱蝽种内遗传距离均小于0.020，种间遗传距离远大于0.020，说明利用遗传距离能够准确鉴别九香虫、小图1九香虫、小皱蝽基于COI引物扩增熔解曲线JXC-01JXC-02JXC-03JXC-04JXC-05XZC-01XZC-02XZC-03XZC-04JXC-01JXC-020.000JXC-030.0000.000JXC-040.0040.0040.004JXC-050.0040.0040.0040.000XZC-010.2250.2250.2250.2270.227XZC-020.2250.2250.2250.2270.2270.000XZC-030.2250.2250.2250.2280.2280.0040.004XZC-040.2310.2310.2310.2330.2330.0050.0050.009XZC-050.2270.2270.2270.2290.2290.0020.0020.0050.007表2种内、种间遗传距离皱蝽。3.3二级结构利 用 载 体 家（https:/ 内 二 级 结 构 基 本 相 同，XZC-03、XZC-04、XZC-05与XZC-01相比分别有2、1、2处主要结构医学心理学62-图2九香虫、小皱蝽COI碱基二级结构不同。从构建二级结构中可以看出，九香虫种内二级结构大致相同，小皱蝽种内二级结构虽有12处不同，但整体框架是相同的。而九香虫与小皱蝽在种间的二级结构整体框架是不同的，具有明显的不同。说明利用二级结构不仅可以对种间进行鉴别，对种内有少量碱基变异的序列也能够显示出来。对于种内变异较少或遗传距离较近的碱基序列，可以通过构建二级结构来更直观地看到发生的碱基变异。3.4NJ系统发育树从GenBank上下载九香虫同属物种黑兜虫（A.nigriventris Westwood）、小皱蝽同属物种刺桐蝽（C.siccifolia Westwood）的COI碱基序列，序列号分别是JQ387600.1、MG838353.1，简称分别是GB-HDC、GB-CTC。对九香虫、小皱蝽测序获得的碱基序列及GenBank上下载的碱基序列利用MEGA11.0软件进行比对分析，设置bootstrap（1