基于PCR的中华蜜蜂囊状幼虫病毒检测技术研究进展_曹旭梅.pdf

JOURNAL OF BEE（Monthly）蜜蜂杂志(月刊)2023 年 第 2 期收稿日期：2022-09-30作者简介：曹旭梅，E-mail：综述基于 PCR的中华蜜蜂囊状幼虫病毒检测技术研究进展曹旭梅，张串联，席芳贵，韩兵庚，张 猛，娄 文，夏晓翠(江西省养蜂研究所，江西南昌3 3 0 0 5 2）摘 要：中华蜜蜂囊状幼虫病毒是中华蜜蜂囊状幼虫病的病原，属单正链小 RNA 病毒，是危害中华蜜蜂最主要的病毒之一。快速、高效、特异性强、灵敏度高的检测方式对遏制中华蜜蜂囊状幼虫病的发生与传播非常重要。对常用的基于 PCR 的中华蜜蜂囊状幼虫病毒检测方法进行了综述，并对它们的优缺点进行了比较，以期为中华蜜蜂囊状幼虫病毒的检测方法提供参考。关键词：中华蜜蜂；中华蜜蜂囊状幼虫病；聚合酶链式反应中图分类号：S895文献标识码：A文章编号：1003-9139（2023）02-0017-06Progress in PCR-based Techniques forDetection of Chiese Sacbrood VirusCAO Xu-mei，ZHANG Chuan-lian，XI Fang-gui，HAN Bing-geng，ZHANG Meng，LOU Wen，XIAXiao-cui(Apiculture Institute of Jiangxi Province,Nanchang330052,China)Abstract:Chinese sacbrood virus is the pathogenof Chinese sacbrood disease.It is a single positive-strandsmall RNA virus and one of the most important virusesthat endangerApis cerana cerana.Rapid,efficient,spe-cific and sensitive detection methods are very importantto curb the occurrence and spread of the Chinesesacbrood disease.In this paper,the commonly usedPCR-based detection methods of Chinese sacbrood viruswere reviewed,and their advantages and disadvantageswere compared,in order to provide reference for the de-tection methods of Chinese sacbrood virus.Keyword:Apis cerana cerana;Chinese sacbroodvirus;Polymerase chain reaction中华蜜蜂（A p i s c e r a n a c e r a n a）作为我国特有的蜜蜂资源，具有擅于利用零星蜜源、采集能力强、耐寒、适应性与抗螨性较强等优点，在维护植物多样性和生态平衡等方面具有重要作用1。但是，多年来中华蜜蜂一直受到中华蜜蜂囊状幼虫病毒（C h i n e s es a c b r o o dv i r u s,C S B V）的侵害。中华蜜蜂囊状幼虫病（以下简称中囊病）来势猛、传播快、病程短，1 9 7 1 年在广东地区爆发后，迅速蔓延至全国的中蜂饲养区2，至今仍是对中国中蜂产业危害最为严重的疾病之一。它的病原是 C S B V，属软腐病病毒科（I f l a v i r u s）、肠道病毒属（E n t e r o v i r u s），是单股正链小 R N A病毒，大小约 8.8 k b，只有一个开放阅读框（O p e nR e a d i n gF r a m e,O R F），其中结构基因在编码区的 5 末端，非结构基因在 3 末端3。该病毒主要感染 1 3 日龄幼虫，使其不能化蛹而死亡4，造成蜂群群势快速下降甚至全群覆灭，严重影响养蜂生产5。建立快速、高效、灵敏的病毒检测方法，对病毒预防和治疗有重要意义。随着分子生物学的发展，病毒检测变得更加快速、简 便、精 确。聚 合 酶 链 式 反 应（P o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n,P C R）技术具有高效快速、特异性高、灵敏度好等优点，被广泛用于蜜蜂病毒病的检测6-1 0。基于 P C R技术的C S B V检测方法已成为当前的主流技术4,1 1-1 3。本文对常用的基于 P C R技术的 C S B V检测方法的原理、特点等进行综述，并比较其优缺点，为选用合适的 C S B V检测方法提供参考。17蜜蜂杂志(月刊)JOURNAL OF BEE（Monthly）NO.22023Feb.1 聚合酶链式反应（PCR）1 9 8 3 年 K a r r y M u l l i s 提出关于聚合酶链反应技术的设想，1 9 8 5 年正式发表关于 P C R的报道1 4，现已成为分子生物学重要的分析工具。P C R是一种体外酶促合成特定 D N A片段的方法，基本原理是在体外通过模拟 D N A体内复制过程进行 D N A的特异性扩增，其特异性依赖于靶序列两端互补的寡聚核苷酸引物。该反应主要包括变性、退火、延伸 3 个步骤：（1）变性：在加热（约 9 4 ）条件下，D N A双链间的氢键断裂，D N A双链解开成为 2 条单链。（2）退火：体系温度降至 5 5 左右，模板 D N A单链与引物根据碱基互补配对原则互补结合。（3）延伸：体系温度升高至7 2，在 D N A聚合酶的作用下，以 d N T P为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对和半保留复制原理，合成一条新的与模板 D N A链互补的半保留复制链1 5。通过重复循环变性、退火和延伸这 3 个步骤约 3 0 次就可以将待扩增的目的基因扩增几百万倍，整个过程在2 4 h 就能完成1 6。因此，P C R具有便捷、产率高、特异性好、灵敏度高和扩增模板纯度要求低等优点，广泛应用于医学、生物学等领域的科学研究1 7。2 基于 PCR 的中华蜜蜂囊状幼虫病毒检测方法随着 P C R技术的飞速发展，基于 P C R理论的基因扩增技术应运而生，这些技术也被广泛应用于 C S B V检测，满足快速准确、高通量和低成本等检测需求。2.1逆转录聚合酶链式反应（Reverse transcriptionPCR,RT-PCR）R T-P C R是一种常用的特异性扩增基因片段的方法，在逆转录酶的作用下，以 R N A为模板将其逆转录为 c D N A，然后对 c D N A进行P C R，使得 R N A在体外大量扩增1 8。R T-P C R有一步法和两步法 2 种，主要区别是一步法R T-P C R的反转录和 P C R反应可在同一体系内进行，无需开盖移液，与两步法 R T-P C R相比，一步法能够避免多次取样造成的污染，反应时间更短，但其灵敏度会比两步法反应低1 9。R T-P C R技术具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点，广泛用于 C S B V的快速检测。目前已有多位学者建立 C S B V的 R T-P C R检测方法2 0-2 3，张明华等建立的 C S B VR T-P C R检测方法最低检测质量浓度可低至 2.8 2 f g/m L2 3。该方法的建立可为 C S B D的流行情况调查提供数据支撑2 4-2 8，也可用于检测细胞中基因的表达水平、C S B V的病毒含量2 9,3 0。另外，感染 C S-B V蜜蜂样本经测序后，可用于比较不同地区的 C S B V基因片段序列3 1，从而为 C S B V的分型诊断提供理论支持。2.2 实时荧光定量PCR（QuantitativerealtimePCR,RT-qPCR）R T-q P C R是一种将 P C R技术与荧光技术相结合的方法，其基本原理是在反应体系中加入荧光物质，利用荧光信号积累实时监测整个P C R进程，再通过用标准曲线对未知模板进行定量分析3 2-3 5，常用的检测方法有 D N A染料法和荧光探针法。R T-q P C R实现了 P C R从定性分析到定量分析的跨越，有自动化、特异性强、灵敏度高、定量准确、重复性好和全封闭反应等优点，普遍用于动物疫病诊断3 6。K u k i e l k a 等根据 S B V的基因组序列设计特异性引物，建立了快速检测 S B V的一步法 R T-q P C R，可定量分析 S B V的含量，每个反应体系的检测限2 9 8.9 个拷贝3 7。宋战昀等根据 S B V的保守序列并结合 T a q M a n 探针设计原理设计特异性引物和探针，建立了一种基于 T a q M a n探针的S B V荧光 P C R检测方法，该方法与多种蜜蜂病毒均无交叉反应，特异性良好，检测灵敏度为 1.0 1 02拷贝/L，适用于蜜蜂样本和蜂蜜、花粉等蜂制品中的 S B V检测3 8。马鸣潇等针对 C S B V的 V P 1结构蛋白基因设计特异性引物和探针，建立了 C S B V的 T a q M a n M G B探针荧光实时定量 P C R快速检测方法，敏感性优于普通 R T-P C R，检出限为 5 0个拷贝3 9。黄伟峰等根据结构蛋白 V P 1 保守区域建立的T a q M a n-M G B探针定量 P C R法可广泛用于东方蜜蜂、西方蜜蜂和墨胸胡蜂检测，当反应温度范围设置在 5 7 6 1 时，其检测限为 6.9 6 9个拷贝，兼具通用性好、特异性强、灵敏度高18JOURNAL OF BEE（Monthly）蜜蜂杂志(月刊)2023 年 第 2 期和可靠性优等优点1 3。2.3 多重 PCR（Multiplex PCR）多重 P C R技术是由普通 R T-P C R改进发展的 P C R技术，基本原理与普通 R T-P C R类似，区别在于多重 P C R在同一体系中加入了 2对以上的特异性引物4 0，可同时检测多种病毒。林丽花等根据 C S B V核酸特征设计特异性引物，建立了可同时鉴定 C S B V和东方蜜蜂微孢子虫（N o s e m a c e r a n a e,N c）2 种病原的二重P C R检测方法，灵敏度可分别低至 6 个与 3 个拷贝4 1。C a g i r g a n 等设计了 S B V等 7 对病毒的特异性引物，建立了可同时检测包括 S B V在内的 7 种蜜蜂病毒的多重 P C R检测方法，灵敏度达 1 1 04拷贝/L4 2。多重 P C R检测方法既能节约检测时间，也能降低病毒的检测成本，适用多种隐形感染的病毒快速检测。2.4 巢式 PCR（Nested PCR）巢式 P C R通过利用 2 套 P C R引物对进行2 轮 P C R扩增反应以增强反应的灵敏度和特异性，第一套引物叫作外引物，第二套引物叫作内引物，通常是先用第一套引物扩增D N A片段，再将 P C R产物用作第二套引物的模板4 3。巢式 P C R可以省去扩增片段测序的过程，只要扩增出来的片段符合预期大小即可，具有高效率、高通量和低成本的特性，适合检测低拷贝的基因。许益鹏等根据病毒保守区设计巢式引物，通过 R N A反转录结合巢式P C R的方法扩增病毒的特征核苷酸区域，成功建立 S B V的巢式 P C R检测，使用巢式 P C R与普通 R T-P C R检测感染 C S B V的蜜蜂均能扩增出相应的目的条带，而使用巢式 P C R检测没有感染 C S B V的健康蜂群不能扩增出条带，检测结果的特异性和灵敏度均较好4 4。2.5 梯度条带 PCR（Gradient band PCR）梯度条带 P C R可同时进行多个不同退火温度的扩增反应，可以快速确定最适合的退火温度4