基于E165R基因非洲猪瘟LAMP快速检测方法的建立_林涛.pdf

书书书贵州农业科学 ，（）：收稿日期：基金项目：福建省自然科学基金项目（）作者简介：林涛（），男，在读硕士，研究方向：生物技术。：通讯作者：张怀东（），男，副研究员，博士，从事病毒学研究。：刘峰（），男，副教授，硕士，从事工业微生物研究。：基于 基因非洲猪瘟 快速检测方法的建立林涛，陈珺煜，王成龙，李芹，张怀东，刘峰，（福建师范大学 生命科学学院，福建 福州 ；工业微生物发酵技术国家地方联合工程研究中心，福建 福州 ）摘要：【目的】建立特异性好、灵敏度高的非洲猪瘟病毒（，）环介导等温扩增（，）快速检测方法，为非洲猪瘟的实时实地快速检测提供参考。【方法】通过对非洲猪瘟病毒多种基因型 个毒株的 基因多序列比对，选取相对保守区域设计 引物，并对反应条件及反应体系进行优化。在获得的最优反应条件及体系下考察方法的检测特异性和灵敏性。【结果】选取的 检测靶标 （）在不同基因型 毒株中保守性较好，序列相似度达 ；反应的最佳温度为 、时间为 、浓度为 、内外引物比为、聚合酶量为。建立的 环介导等温扩增检测方法最低检测限为 ，较常规 检测提高个数量级，且 即可完成扩增反应。检测方法与猪圆环病毒型（）、伪狂犬病毒（）、猪繁殖与呼吸道综合症病毒（）和猪瘟病毒（）种临床症状类似的猪病毒感染性疫病没有交叉反应。【结论】基于该新检测靶点的 检测具有良好的特异性，可成功区分与 感染临床症状相似的猪感染性疾病，且灵敏度优于常规 检测方法，方法简单、检测成本低，可实现 的特异、灵敏、快速检测。关键词：非洲猪瘟病毒；基因；环介导等温扩增；快速检测；特异性；灵敏性中图分类号：文献标识码：文章编号：（）（），（，；，）：【】（）（）【】【】（），：（），（）（，）【】，（），：（）；（）；引言【研究意义】非洲猪瘟（，）是由非洲猪瘟病毒（，）引起的具有高度传染性的动物疫病，年肯尼亚首次报告感染病例，并 迅 速 蔓 延 至 全 球 几 十 个 国 家。年，我国首次报道了 感染。疫情暴发以来，据国家统计局数据显示，年和 年生猪出栏数同比下降 和 。猪肉是我国需求最大的肉类，非洲猪瘟病毒感染与传播对我国生猪养殖业造成了巨大冲击。感染的临床症状取决于感染毒株的毒性，可分为最急性、急性、亚急性和慢性。临床症状主要为高热、组织水肿和出血性病变，最急性病毒导致的死亡率可达 。由于该病毒生物学特性及免疫逃逸机制复杂，目前仍无有效的预防和治疗手段，对于 感染的防控主要依靠病猪无害化处理。然而，在环境中的高度稳定，可以在猪肉及其副产品上长期存活，甚至可以在衣服、鞋子、车轮等污染物上存活，一旦发生疫情，很难根除，这些污染物也是病毒传播的媒介，或将导致病毒二次传播。因此，进一步加强对非洲猪瘟疫情的快速响应和及时防控显得尤为重要，而建立快速、简单的 检测方法是防治 的关键。【前人研究进展】的主要检测方法有免疫学检测方法和基于 的核酸检测方法，这种方法较传统的病毒分离、鉴定方法更加快速、便捷和灵敏。基于 的核酸检测方法可应用于病毒感染初期，机体尚未产生特异性抗体之前，其灵敏度高于抗体和抗原检测，更适用于早期快速确诊。目前，基于 方法已建立了多种 的快速诊断方法，如实时荧光定量 （，）、重组酶聚合酶扩增技术（，）、重组酶介导等温 扩 增技术（，）、环介导等温扩增（，）等，其中，是实验室检测 的金标准，但由于 涉及的仪器和材料昂贵、一次检测成本较高及需专人操作，不能满足实验设备不足的实验室、养猪场等的快速检测需求。由 于 年首次提出，通过条特殊设计的引物和具有链置换活性 聚合酶，在恒温下反应扩增 特 定 的 序 列，整 个 扩 增 过 程 不 超 过 。最常用判断结果的方法是电泳，结果会呈现出阶梯状的特异性条带。随着扩增进行副产物焦磷酸镁沉淀不断生成，连接到实时浊度仪后可实时监测反应结果；此外，也 可 以 加 入 染 料 实 现 肉 眼 判 读 结果 ，或是联用智能设备实现高通量检测。【研究切入点】在 的 检测中，最常用的靶标是 基因（编码 蛋白），其同时也是世界动物卫生组织（，）推荐的 检测靶标。由于 具有多种基因分型，且病毒具有较强的基因变异能力，开发适用于多种 毒株的检测新靶标及检测方法，对于实现 的高灵敏、特异性快速检测非常重要。近年来，一些 新 的 检 测 靶 标，如 、等也陆续被报道。基因编码 保真复制所必须的脱氧尿苷三磷酸核苷 酸 水 解 酶（，）可 起到修复 损伤、阻止尿嘧啶掺入 等作用，在 生命周期中起重要作用。【拟解决的关键问题】选取 基因上的保守区段进行 引物设计和考察，对 反 应 体 系 进 行 条 件 优 化，建 立 以期林涛 等基于 基因非洲猪瘟 快速检测方法的建立 基因为新靶点的 检测方法，实现 的早期现场快速检测。材料与方法 试剂与仪器质粒提取试剂盒、聚合酶、核酸染料均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；和琼脂糖购自生工生物工程（上海）股份有限公司；上样缓冲液购自上海碧云天生物技术有限公司；含有 基因的质粒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒（，）、猪瘟病毒（，）基因组 、伪狂犬病病毒（，）和猪圆环病毒型（，）基因组 均由福建师范大学生命科学学院提供。梯度 仪和凝胶成像分析系统购自美国 公司，电泳仪电源购自北京六一仪器厂，微量移液器购自德国 公司。研究所用化学 品 均 为 分析级。引物设计根据美国国立生物技术信息中心（，）公布的 基因组完整序列，选取 基因，使用 （：）进行序列比对，结果使用软件 优化。根据序列比对结果选择保守区段，运用在线软件 （：）设 计 引物，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。含有 基因 检测模板的制备离心收集 含 质粒的新鲜 菌体，以质粒提取试剂盒提取质粒，微量分光光度计多次测量提取质粒的 浓度，根据公式：拷贝数（浓度体积 ）分子量，将质粒稀释成 ，置于冰上直接进行试验或分装保存于 待用，避免反复冻融。反应体系及其优化 反应体系内引物 和 （）各、外引物 和（）各、聚合酶、模板、（）、（）和 ，以 补至。反应体系的优化 反应温度分别设为、和，以确定体系的最佳反应温度；反应时间设为 组，共 组，各组间隔 ；终浓度梯度分别设为 、和 ，即 分 别 加 入 储 存 液、和；不同的内外引物加入终浓度比例分别设为、和（固定添加 外引物）；聚合酶加入量分别设为、和（即 分 别 对 应 加 入、聚合酶）。反应结束后，取样品 和 上样缓冲液 混合，经琼脂糖凝胶电泳分离后判定检测结果，阳性结果显示特征性阶梯状条带，阴性结果无此特征性条带。基于 基因片段 检测的特异性和灵敏度 特异性检测以 病毒 、的基因组 和病毒 、的 为模板（）进行特异性考察。同时以含有 目的基因质粒为阳性对照，于优化过的最佳反应温度和反应时间下进行反应，反应完成后经琼脂糖凝胶电泳检测、判定结果。灵敏度检测将含有 目的基因的质粒，用 稀释成 、贵 州 农 业 科 学 、和 ，取作为模板于优化过的最佳反应温度和反应时间下进行反应，反应完成后经琼脂糖凝胶电泳检测并判定结果。外引物用于考察普通 （反应体系为）的灵敏度：将含有目的基因的质粒用 稀释成 、和 ，取作为模板进行反应。反应体系包括 、上下游引 物 各、稀 释 过 的 质 粒以 补至终体积。反应条件：；，个循环；。结果与分析 引物的确定从 上获取 条不同基因型 的 基因序列，与 病毒株（登录号：）进行序列比对，最终选取 （）为 检测靶标。为更清晰地展示比对结果，仅选取 条序列比对结果进行详细展示（图）。由图可知，选用为 检测靶基因的 基因片段在不同基因型（、和）毒株中保守性较好，序列相似度达 。最终选用的最佳 引物组位置和序列见表。注：、为毒株病毒基因型编号，为未分型病毒株。、为外引物，和 组合后为内引物 ，和 组合后为内引物 。：，（）（）图不同 毒株 基因的多序列比对结果及引物设计区段标注 表基于 基因设计的 引物 引物 序列 （）期林涛 等基于 基因非洲猪瘟 快速检测方法的建立 反应体系的优化 反应温度与反应时间由图 可知，反应的最佳温度为。反应时间为 时，可获得基于 基因及所用引物组的一致性 检测结果。其中，虽然反应时间为 时获得的检测效果最好，但基于快速检测的目的和对检测效 果 的 综 合 考 虑，选 择 最 佳 反 应 时 间 为 进行后续检测。图 基因片段及设计引物组的 检测最佳反应温度（）和最佳反应时间（）的电泳结果 （）（）和 聚合酶的加入量及内外引物的比例由图可知，反应体系加入的最佳 浓度为 ，最佳内外引物比例为，最佳 聚合酶量为。其中，是 聚合酶的 激 活 剂，当 超 过 其 最 佳 浓 度（）达 时，削 弱 了 扩增反应的扩增效果，说明 浓度对 扩增效果的影响非常显著，一定范围内与 浓度呈正相关，浓度过高可能会通过抑制 聚合酶酶活或导致引物二聚体增多等影响整个 反应的扩增效果。另还发现，添加环引物未显著影响 反应扩增效果（数据未展示），故研究采用条内外引物进行后续 扩增反应。图 终浓度（）、内外引物加入比例（）和 聚合酶加入量（）反应的电泳结果 （），（）（）反应特异性和灵敏度 特异性在 检测中，实现对种 猪圆环病毒型（）、伪狂犬病毒（）、猪繁殖与呼吸道综合症病毒（）和猪瘟病毒（）与 感染临床症状相似病毒的特异性区分，对及时采取精准防控措施具有十分关键的作用。选用的检测靶点及其 引物组的特异性（图）只含有检测目的基因的阳性样本被检出，显示良好的检测特异性，可实现对几种临床症状相似猪感染性疫病的特异性区分和对 的精准快速检测。贵 州 农 业 科 学图 基因片段及设计引物组的 特异性检测电泳结果 灵 敏 性检 测 限（，）定义为一个反应体系内加入的阳性质粒拷贝数。稀释好的质粒溶液加入到 反应体系中，反应体系为，于 恒温反应 的凝胶电泳检测结果（图）表明，在质粒拷贝数为 时，可见微弱的特征性 阶梯型电泳条带，整体效果较差；在质粒拷贝数为 时，可见明显的特征性 阶梯型电泳条带，较普通 的 （图）高约个数量级，能更好地适用于 感染的早期快速检测。注：为 检测的灵敏度，为以外引物进行的普通 检测灵敏度 ：，图基于 基因片段的 灵敏度检测电泳结果 讨论由于 的高感染率和高致死率，以及缺乏有效的预防和治疗措施，到目前为止，快速和准确的诊断对于 快速精准防控至关重要。由于病毒株的多样性和遗传变异性，发现保守的新检测靶标对于建立 的特异性高灵敏检测方法仍十分重要。我国当前流行的是基因 型和基因型 毒株，临床感染危害巨大。研究以 为新的检 测 靶 点 设 计 引 物 组，建 立 的 检测方法特异性强、灵敏度高，且简单快速。检测靶点因在 型和 型基因型等多种基因型病毒中，以及一些未分型 中都相对保守，可实现对多种 毒株的 检测，更适用于跨地域养殖场所开展广泛的筛查。其优越的检测特异性、灵敏性更保证了检测质量，为 的快速检测、精准防控提供新的方法参考。检测方法不仅可直接用电泳形式进行检测，更可与染料，如钙黄绿素 或羟基萘酚蓝等染料联用，实现检测结果的直接肉眼判定，更能避免开盖检测可能产生的气溶胶污染，避免检测场所的污染及假阳性结果，更好地实现 的现场、快速检测诊断。结论建立 的 环 介 导 等 温 扩 增（期林涛 等基于 基因非洲猪瘟 快速检测方法的建立 ，）检测方法，选取的 检测靶标为 （），反 应的 最 佳温 度 为，时间为 ，浓度为 ，内外引物比为，聚合酶量为 。检 测 方 法 最 低 检 测 限 为 ，检测方法与几种临床症状类似的猪病毒感染性疫病无交叉反应。检测特异性良好，灵敏度优，可成功区分与 临床症状相似的猪感染性疾病，实现 的特异、灵敏、快速检测。参考文献 ：（），：，：，（）：，：，：，：，（），（）：，：，：，（），：，（），（）：，（），：，（）：，（）：，：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，（），：，（）：，（）（），：，（）：，（），（）：（责任编辑：聂克艳）贵 州 农 业 科 学