湖泊湿地石油烃降解菌筛选与原油动-静态降解研究_贾辉.pdf

湖泊湿地石油烃降解菌筛选与原油动-静态降解研究贾辉，杨果，孙冰洁，谢子阳，刘海军*（安庆师范大学 资源环境学院，安徽 安庆 246133）摘要：筛选石油烃高效降解菌有利于石油污染湖泊湿地的原位修复。本文以原油为唯一碳源，从安庆湿地的石油烃污染水体中筛选出了一株原油高效降解菌，经形态学和16S rRNA测序鉴定为芽孢杆菌（命名为Bacillus sp.L1）。并利用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）分析了该菌在实验室动态（37 C，180 r/min）和静态（37 C，0 r/min）培养3个月的原油降解效果。原油动-静态降解结果发现该菌株在动态下对nC13nC35（M/Z=85）的降解率在86%100%之间；静态下nC13nC19的降解率在95%100%，但nC20nC35的降解率在69%97%之间，整体呈现随着分子量变大降解效率下降的趋势。与此同时，该菌在动-静态下均可以有效降解原油中烷基环己烷（M/Z=82）、烷基苯（M/Z=92）和烷基甲苯（M/Z=106）等组分，而且，对原油中大部分芳香族化合物也具有一定程度的降解，同时芳香族同系物家族内部各分子降解难易程度也存在差异。Bacillus sp.L1在动-静态降解条件下对石油主要组分均表现出良好的降解潜能，并在一定程度上动态降解效果优于静态降解，这在自然湿地石油类污染的生物修复领域具有良好的应用前景。关键词：湖泊湿地；石油污染；芽孢杆菌；动-静态降解；芳香族同系物；生物修复中图分类号：X52文献标志码：A文章编号：1007-4260（2023）01-0098-08Screening of Crude-Oil Degrading Bacteria from a Lake Wetlandand the Dynamic-Static DegradationJIAHui,YANG Guo,SUN Bingjie,XIE Ziyang,LIU Haijun*(School of Resources and Environment,Anqing Normal University,Anqing 246133,China)Abstract:Screening bacteria of degrading crude oil efficiently will benefit in-situ remediation of oil-polluted lake wet-lands.In this paper,one strain was isolated from the oil-polluted lake wetland in Anqing by using crude oil as the sole carbon,named Bacillus sp.L1 according to the typical morphological characterization and 16S rRNA sequencing.Gas chromatogra-phy-massspectrometry(GC-MS)wascarriedouttodetectcrude-oildegradationconditionsunderthedynamiccultivation(37C,180 r/min)and static cultivation(37 C,0 r/min)during 3 months in the laboratory.It found that the degradation rate of nC13nC35(M/Z=85)in crude oil ranged from 86%to 100%under the dynamic cultivation.Besides,the rate of nC13nC19ranged from 95%to 100%under the static cultivation,as well as a lower rate range from 69%to 97%for nC20nC35,show-ing a decrease tendency of the degrading ability with the increasing of molecular weight on the whole.Additionally,the straincould fully utilize crude oil compositions of alkylcyclohexane(M/Z=82),alkylbenzene(M/Z=92)and alkyltoluene(M/Z=106)under both cultivation conditions.Furthermore,Bacillus sp.L1 has a capability of degrading most aromatic compoundsin crude oil to a certain extent,emerging different degradation ability of various compounds within the family of aromatic ho-mologues.Our study revealed that Bacillus sp.L1 has a good degradation potential of crude oil compositions under the dynam-ic-static cultivation,and the degrading effect under dynamic cultivation is generally better than the static.This finding shouldbe very helpful for the bioremediation of crude-oil polluted natural wetlands.Keywords:lakewetlands;crude-oilpollution;Bacillus;dynamic-staticdegradation;aromatichomologues;bioremediation收稿日期：2021-09-30基金项目：安徽省教育厅重大项目（2022AH040141），安徽省教育厅重点项目（KJ2020A0501），高校优秀青年骨干人才国内访学项目（gxgnfx2021129），安庆师范大学科研创新团队项目（湿地污染生态学）和安徽省大学生创新训练项目（S202110732083）作者简介：贾辉（1997），男，安徽亳州人，安庆师范大学资源环境学院硕士研究生，研究方向为环境微生物学。E-mail：通信作者：刘海军（1984），男，湖北黄冈人，博士，安庆师范大学资源环境学院副教授，研究方向为石油微生物降解与生态修复。E-mail：2023年2月第29卷第1期安庆师范大学学报（自然科学版）Journal ofAnqing Normal University（Natural Science Edition）Feb.2023Vol.29 No.1DOI：10.13757/34-1328/n.2023.01.017第1期湿地是在陆生和水生生态之间形成的独特生态系统，具有重要生态功能和经济价值1。伴随着原油开采和石油产品加工等持续进行，湖泊湿地、滨海湿地、沼泽湿地等重要生态系统均遭受了不同程度的石油类污染威胁，其带来的诸多问题正日益受到关注。目前，在众多石油污染物去除方法中，微生物修复技术具有环境干扰小、效率高、经济实惠等优点，备受青睐，在石油污染生态修复领域具有广阔的应用前景2。自然界蕴藏着丰富的石油降解微生物，其石油降解潜能亦不相同。杨智等3从石油污染土壤中分离了一株石油降解菌Pseudomonas aeruginosa 1217，其培养7天的原油（500 mg/L）降解率在15%以上。Bovio等4从石油污染的地中海水体筛选的海洋真菌Aspergillus terreus培养10 天的石油烃（1%w/v）降解效率可达40%。肖建军等5从石油污染土壤筛选出一株苯降解菌Ochrobactrum MB-2，在35 C和pH7.0条件下培养3天的苯（5 mg/L）降解率高达98.65%。李丹丹等6以十六烷为唯一碳源从莫莫格湿地石油污染土壤分离了一株石油烃降解菌Pseudomonas aeruginosa JLC1，在35 C下培养14天的十六烷降解率高达99%。与此同时，芽孢杆菌（Bacillus）作为自然界中一类广泛存在的细菌，往往具有良好的石油烃降解潜能，其对石油组分的降解也呈现差异性。据报道Bacillus thuringiensis培养9天的苯并a芘（0.5 mg/L）降解率达 80%7、Bacillus thuringiensis AT.ISM.1 培养 14 天的蒽（40 mg/L）降解率高达 91%8、Bacillusthuringiensis AT.ISM.11培养15天的菲（40 ppm）降解率为65.71%9、Bacillus subtilis 3KP培养7天对200ppm的萘和菲降解率分别为70.5%和24.8%10、Bacillus atrophaeus CN4培养12小时的萘（0.2 mmol/L）降解率为69%11，以及Bacillus amyloliquefaciens培养28天的十六烷（1%v/v）降解率高达99.6%12。本文利用原油作为筛选压力从湖泊湿地石油污染的水体筛选出了一株高效石油烃降解菌，并结合形态学特征和16S rDNA序列分析对其进行种属鉴定；同时，利用GC-MS系统探索该菌在实验室动态和静态条件下对原油中烷烃和芳香族化合物的降解潜力，以期为自然湿地石油污染的微生物修复过程提供理论指导和技术支撑。1材料与方法1.1材料1.1.1降解菌株安庆沿江湖泊湿地（E11607-11744，N2950-3058）部分水域存在较为明显的有机污染物污染，水体油类含量达到（0.180.20）mg/L。本实验利用采样器采集西小湖沉积物-水界面的水样，并用蓝盖瓶密封带回实验室。在装有100 mL无机盐驯化培养基的250 mL西林瓶中接入5 mL湖泊水样，然后用封口膜密封并用牛皮纸包裹以防溶液挥发，于37 C和180 rpm的条件下驯化富集，每次周期1个月，连续驯化3次。同时，每次均使用新的无机盐驯化培养基和上一批次驯化的种子液。最终，采用牛肉膏蛋白胨固体培养基作稀释涂布平板，筛选获得实验用菌株。1.1.2培养基牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂20.0 g，蒸馏水1 L，pH值调至7.2左右，在121 C下高温灭菌30 min。无机盐驯化培养基：NaCl 5.0 g，KH2PO45.0 g，(NH4)2SO41.0 g，K2HPO43H2O 1.0 g，MgSO47H2O0.25 g，NaNO32.0 g，FeCl24H2O 0.02 g，CaCl20.02 g，蒸馏水1 L，并添加0.5%（w/v）石油作为唯一碳源，pH值调至7.2左右，在121 C下高温灭菌30 min。1.2方法1.2.1原油降解菌形态学分析细菌形态学分析主要包括：（1）细菌革兰氏染色。将活化的细菌革兰氏染色后，在显微镜下观察菌体的形态。（2）细菌电镜SEM观察。将来自固体平板上的细菌菌落，用2.5%的戊二醛溶液4 C固定过夜，倒掉固定液并收集菌体，用0.1 M（pH=7.0）的磷酸缓冲液漂洗样品3次，15 min/次；用1%的锇酸溶贾辉，杨果，孙冰洁，等：湖泊湿地石油烃降解菌筛选与原油动-静态降解研究 99安庆师范大学学报（自然科学版）2023年液固定样品1-2 h；小心取出锇酸溶液，用0.1 M（pH=7.0）的磷酸缓冲液漂洗样品3次，15 min/次，用梯度浓度（包括30%，50%，70