基于PTPN22干扰的艾灸...-STAT4信号通路的影响_杨馨.pdf

2023 年 3 月第 46 卷第 1 期成都中医药大学学报March 2023，Vol.46，No.1Journal of Chengdu University of TCM实验研究基于 PTPN22 干扰的艾灸对实验性类风湿性关节炎家兔滑膜细胞 JAK1 STAT4 信号通路的影响杨馨，陈俊，路晓清，席东来，唐海婷，杨慎峭，周海燕，马文彬，吴菲(成都中医药大学，四川成都610075)【摘要】目的:研究艾灸对实验性类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，A)大耳白兔滑膜组织非受体 22 型蛋白酪氨酸磷酸酶基因(protein tyrosine phosphatase，nonreceptor type 22，PTPN22)、JAK1 及STAT4 表达的影响，探索慢病毒介导的 PTPN22 干扰对艾灸治疗实验性 A 大耳白兔滑膜细胞 JAK1 STAT4 信号通路的影响。方法:日本大耳白兔随机分为对照组、模型组、艾灸组、PTPN22 干扰组，6 只/组。将 FCA 按0.5 mL/kg 注入模型组、艾灸组及 PTPN22 干扰组动物双后腿膝关节腔内造模，对照组同法注入无菌生理盐水。将慢病毒介导的 PTPN22 NAi 作为干预手段，艾灸组及 PTPN22 干扰组动物双侧“肾俞”“足三里”穴进行小艾炷灸治疗。治疗前后测量各大耳白兔左、右膝关节周长，治疗第 21 天行滑膜取材，采用 T PC 法检测滑膜组织 PTPN22 mNA、JAK1 mNA 及 STAT4 mNA 表达;采用 Western blot 法检测滑膜组织 PTPN22 蛋白表达情况。结果:与对照组相比，模型组大耳白兔双膝关节周长、JAK1 mNA及 STAT4 mNA 的表达升高(P 0.05)，PTPN22 mNA 及蛋白的表达降低(P 0.05);与模型组相比，艾灸组大耳白兔双膝关节周长、JAK1 mNA 及 STAT4 mNA 的表达降低(P 0.05)，PTPN22 mNA 及蛋白的表达升高(P 0.05);与艾灸组相比，PTPN22 干扰组大耳白兔双膝关节周长、JAK1 mNA 及STAT4 mNA 的表达升高(P 0.05)，PTPN22 mNA 及蛋白的表达降低(P 0.05)。结论:艾灸可能通过 PTPN22 途径良性调控 A 中 JAK STAT 通路异常激活的 JAK1 与 STAT4 基因表达水平，负向调节JAK1 STAT4 信号通路而达到抗炎治疗效应，其对 JAK1 STAT4 信号通路的调控可能是艾灸治疗 A 抗炎效应实现的途径之一。【关键词】非受体22 型蛋白酪氨酸磷酸酶基因;JAK1 STAT4 信号通路;负反馈;艾灸;类风湿性关节炎【中图分类号】245.81;593.21【文献标识码】A【文章编号】1004-0668(2023)01-0025-07【DOI 编码】10.13593/ki.51-1501/r.2023.01.025【引文格式】杨馨，陈俊，路晓清，等.基于 PTPN22 干扰的艾灸对实验性类风湿性关节炎家兔滑膜细胞 JAK1 STAT4 信号通路的影响 J.成都中医药大学学报，2023，46(1):25-31.【开放科学(资源服务)标识码(OSID)】【基金项目】国家自然科学基金项目(81973959，81774435，81001555)【第一作者】杨馨，女，1981 年生;医学博士，副教授;E mail:724910170 【通信作者】周海燕，女，1979 年生;医学博士，副教授;E mail:5014296 类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，A)是一种长期的慢性炎症性关节疾病，主要影响自身的关节部位，导致多个关节滑膜的进行性炎症，最终导致关节的破坏、畸形和残疾1，2。目前，A的病因尚未完全了解，但复杂的遗传和环境因素影响 A 的发展3，4。遗传学因素在 A 疾病的易感性中发挥着关键作用，其中非受体 22 型蛋白酪氨酸 磷 酸 酶 基 因(protein tyrosine phosphatase，nonreceptor type 22，PTPN22)被认为是 A 重要的风险 基 因 之 一，参 与 细 胞 免 疫 反 应 及 炎 症 发展5，6。研究发现7，8，在 A 中，PTPN22 是负反馈机制调控 Janus 激酶/信号转导和转录激活因子(JAK/STAT)信号通路的关键基因之一，能有效抑制膝关节滑膜炎症过程的正反馈机制调控。此外，JAK STAT 信号转导通路的促炎细胞因子激活是 A 发病机制和进展的关键事件，进而导致疾52成都中医药大学学报2023 年第 46 卷病的慢性免疫炎症过程的启动和持续存在9，10。本实验基于慢病毒介导的 NAi 干扰技术，在动物体内阻断实验性 A 模型 PTPN22 基因的表达，观察艾灸治疗对实验 A 模型的抗炎消肿作用及滑膜组织 PTPN22、JAK1、STAT4 表达的影响，探讨慢病毒介导的 PTPN22 基因阻断干扰对艾灸治疗实验性A 大耳白兔滑膜组织细胞 JAK1 STAT4 信号通路的影响。1材料与方法1.1实验动物及分组日本大耳白兔24 只，雌雄各半，体重(2.0 0.25)kg。实验动物提供方:成都中医药大学实验动物研究中心，证号:SYXK(川)2019 049。实验动物随机分为四组:空白对照组(简称对照组)、A 模型组(简称模型组)、艾灸治疗组(简称艾灸组)、艾灸+PTPN22 基因干扰组(简称 PT-PN22 干扰组)，6 只/组。动物在正式实验前适应性驯养 7 d。饲养环境:清洁级(CCV 级)饲养室，室温 18左右，相对湿度 70%左右，保持通风换气。1.2主要试剂实验 试 剂:福 氏 完 全 佐 剂(FCA，批 号:Lot101M8711)购自 Sigma 公司;慢病毒载体 pLVX shNA2 PTPN22(1 5 108 TU/mL)购自深圳 Biowit 生物科技有限公司;无水乙醇(批号:110921)、异丙醇(批号:120913)均购自成都科龙化工试剂有限公司;氯仿(批号:67 66 3)购自上海化学试剂有限公司;NA 提取试剂盒(批 号:BK3303)、反 转 录 试 剂 盒(批 号:BK501)、T PC 反应试剂盒(批号:BK402)购自大连宝生物工程有限公司;PTPN22 abbitpAb(A1406，批次:0211530201)购自 ABclonal公司。1.3主要仪器BS 600L 电子天平(上海友声衡器有限公司);PIKOed96T PC 扩增仪(美国 ThermoFisher 仪器有限公司);CLEAVE 垂直电泳槽(Thmorgan 有限公司);TG2 16C 型低温离心机(上海安亭科学仪器厂);DY89 I 型匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司);SK12 6 型电热恒温水浴锅(浙江宁波医疗器械厂);DYY 2C 型电泳仪(南京普阳科学仪器研究所);UV Transilluminator 化学发光凝胶成像仪(美国 Bio AD 公司)。1.4治疗材料艾粒(6.8 mm 26 mm，南阳汉医艾绒有限责任公司)1.5A 模型塑造于实验第一天，将模型组、艾灸组及 PTPN22干扰组动物的实验部位(后腿双膝关节)剃毛，固定膝关节于微屈曲位并进行消毒(10%异丙醇)，将 FCA 按0.5 mL/kg 的规格于穿刺点(髌骨下缘，膑韧带外侧凹陷)注入 3 组动物膝关节腔内11。同法将对照组的膝关节腔注入无菌生理盐水作为对照。1.6慢病毒介导 NAi 基因干扰技术于 A 造模后第 2 天以及艾灸治疗第 10 天，根据文献12，13 以 40 L/只的规格将慢病毒载体(pLVX shNA2 PTPN22)于穿刺点(同上)注入 PTPN22 干扰组动物膝关节腔内，其余 3 组同法注入无菌生理盐水。1.7治疗方法于实验性 A 造模后第 7 天开始，每日在相同时间段对艾灸组及 PTPN22 干扰组动物进行艾灸治疗。具体方法:使用小艾炷灸作为治疗手段，施灸于日本大耳白兔两侧“肾俞”“足三里”穴各 5壮，1 次/d，6 d 为一疗程，共艾灸治疗 3 个疗程，疗程之间休息 1 d。其余 2 组(对照组、模型组)日本大耳白兔仅同法固定，但不艾灸治疗。1.8观察指标及检测方法1.8.1膝关节周长测量于 A 造模前及艾灸治疗开始后第 3、6、9、12、15、18、21 天分别测定大耳白兔左、右膝关节周长并详细记录数据。1.8.2膝关节滑膜组织取材艾灸治疗第 21 天，处死各实验组动物，充分暴露实验取材部位(约 3 cm 3 cm)，使用实验器具完整分离膑骨并提取其表面延续的淡黄色滑膜组织。滑膜组织取材完成后液氮冷冻保存。1.8.3T PC 法 检 测 滑 膜 组 织 中 PTPN22mNA、JAK1 mNA、STAT4 mNA 的表达情况样本总 NA 抽取:滑膜组织加入处理后的试剂(NAiso Plus)快速搅拌均匀离心，上清液移至新离心管;加入氯仿再次离心 15 min，上清液移至新 EP 管;等体积的异丙醇加入，再次离心取得NA 沉淀;加入75%乙醇1 mL 离心5 min，去除乙醇;加入适量 Nase free 水溶解沉淀，待至 NA沉淀完全溶解后于 80保存。NA 逆转录合成cDNA:依次加入试剂进行 42金属浴，2 min。根据条件置 PC 仪上进行反应，结束后离心 20 保存。实时荧光定量 PC 反应:反应条件:9530 s、95 5 s、55 30 s、72 30 s，共 40 循环。引物见表1。实验结果采用2 CT表示。62第 1 期杨馨 等基于 PTPN22 干扰的艾灸对实验性类风湿性关节炎家兔滑膜细胞JAK1 STAT4 信号通路的影响1.8.4Western blot 法检测实验动物滑膜组织 PT-PN22 蛋白表达情况配胶、上样、电泳:配分离胶(10%)，浓缩胶(5%)，灌胶，加去离子水液封;上样;电泳至溴酚兰染料至胶底停止电泳。转膜:转膜条件电流 200 mA，1 2 h。封闭。孵育抗体:一抗孵育(PTPN22 稀释浓度为 1 1 000 中放入硝酸纤维素膜并摇床上轻摇，4 环境孵育过夜)、洗膜、二抗孵育(稀释浓度为 1 10 000)、洗膜。显影、定影:孵育完成的 PVDF 膜平铺于保鲜膜，固定于片夹上放入成像仪。凝胶图像分析:分析目标带的灰度值，实验结果以目的蛋白相对表达量来表示。1.9数据处理用 SPSS13.0 软件进行统计处理，数据以 x s表示。组间比较用单因素方差分析，方差齐则选用 LSD 检验，方差不齐则选用 Tamhane s T2 检验，以 P 0.05 为差异有统计学意义。表 1引物基因名称上游引物下游引物扩增产物(bp)PTPN22CTGAGAGGGAAATCGTGCGGACTCGGATTCCATACCCAA30GAPDH 2GAACAACTGACGTAGCGCCTAAGTTCGGAGGTAAGGCTCATG31JAK1CAGGTCTCCCACAAGCACATCGCCCTCCTTCCACAAACTCTT91STAT4GCCCTCAGTAAGATGACGCAATTCCGCCAATAGTGTAAAGCAG168GAPDHAGGTCGGAGTGAACGGATTTGGTGGAGGTCAATGAATGGAT1112实验结果2.1艾灸对实验性 A 大耳白兔膝关节周长的影响造模前，各组间大耳白兔左、右后膝关节周长差异均无统计学意义(P 0.05)，具有可比性;与对照组相比，各个时间节点模型组左、右后膝关节周长均增加(P 0.01)，说明滑膜组织肿胀反应持续存在，炎症模型塑造成功;治疗第 6、9、12、15、18、21 天，艾灸组大耳白兔左、右后膝关节周长均较模型组减少(P 0.05);治疗第 9、12、15、18、21 天，PTPN22 干扰组大耳白兔左、右后膝关节周长均较艾灸组增加(P 0.05)。提示艾灸治疗实验性 A 明确发挥了抗炎消肿作用，但在 PTPN22