基于UPLC-Q-TOF_...及其与栀子药材成分差异分析_刘和平.pdf

第 卷 第 期 年 月 成都大学学报（自然科学版）（）文章编号：（）：收稿日期：基金项目：四川省科技成果转化示范项目（）作者简介：刘和平（），男，硕士，高级工程师，从事中药新药开发与生药研究：通信作者：尚 强（），男，博士，高级工程师，从事中药新药开发研究：基于 的水栀子药材指纹图谱建立及其与栀子药材成分差异分析刘和平，巫登菊，余孝云，郭 伦，蔡信福，尚 强，（四川光大制药有限公司，四川 成都；国家中药现代化技术研究中心 川药资源分中心，四川 成都；暨南大学 药学院，广东 广州；健康元药业集团股份有限公司，广东 深圳；四川省抗病毒中药产业化工程技术研究中心，四川 成都）摘 要：建立水栀子药材超高效液相质谱联用指纹图谱，分析水栀子与栀子药材指纹图谱的差异 采用 甲醇超声提取，超高效液相色谱法测定指纹图谱，结合质谱、保留指数和相关文献对部分色谱峰定性鉴别；并通过相似度评价和主成分分析水栀子与栀子药材所含主要指标性成分的差异 结果显示，水栀子指纹图谱共有 个共有峰，确定了其中的 个成分 水栀子与栀子药材相似度较为一致，主成分分析可以准确区分水栀子与栀子药材 所建立的指纹图谱测定方法可以用于水栀子与栀子药材的鉴别，研究结果为水栀子与栀子药材真伪品鉴定提供了实验依据关键词：水栀子；栀子；指纹图谱；液相色谱；相似度；主成分分析中图分类号：文献标志码：引 言 水栀子为茜草科（）栀子属（）栀子（）多个变种药材商品名的统称 经市场调研，目前市场流通的水栀子基源主要为茜草科植物大花栀子（）和长果栀子（）的干燥果实 文献报道，水栀子和栀子药材均主要含有单萜（主要是环烯醚萜）、藏红花素、三萜、黄酮、香豆素、有机酸和挥发类成分等，所含成分具有明显的镇痛、抗炎、降血糖、保肝和抗抑郁等药理作用或生物活性 栀子为常用中药材，具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒和外用消肿止痛的功效，而水栀子现多用于提取食品黄色素，不作为中药材使用，但市场常见有水栀子药材冒充栀子药材出售 近年来，针对水栀子的单一成分的质量控制，大多集中在指标性成分栀子苷、西红花苷和西红花苷的含量测定 其他的文献报道，主要是通过药材性状、横切面显微和薄层色谱等方面对水栀子与栀子药材进行鉴别的研究，未见有水栀子与栀子药材超高效液相质谱联用（）指纹图谱对比研究的文献报道 本研究通过对水栀子果实超高效液相（）指纹图谱方法的建立，研究了水栀子与栀子药材所含主要成分组成和比例差异，为今后水栀子与栀子药材基源鉴定提供数据支持 材 料 仪 器 型超高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司），型四极杆飞行时间高分辨质谱仪（沃特世科技有限公司），型双频数控超声清洗器（昆山超声仪器有限公司），型十万分之一电子天平（梅特勒托利多集团）材 料西红花苷对照品（批号，）、西红花苷对照品（批号，）、栀子苷对照品（批号，）、绿原酸对照品（批号，）、京尼平苷酸对照品（批号，），均购自中国食品药品检定研究院；京尼平龙胆双糖苷对照品（批号，）、山栀子苷 对照品（批号，），均购自深圳健竹生物科技有限公司；水为自制超纯水，乙腈为色谱纯和质谱纯，甲醇等其他试剂均为分析纯 从安徽宣城市（宣州区、广德县和郎溪县），以及广西玉林市水栀子人工种植基地收集了 批样品，从安徽亳州、河北安国、广州清平和江西樟树等中药材市场收集了 批不同产地的商品水栀子样品和 批栀子样品，共 批，样本收集信息见表 所有样本的药材基原，经暨南大学药学院周光雄教授鉴定，凭证标本存于丽珠医药集团中药研究院生药资源中心表 样本收集信息及相似度计算结果汇总表序号名称编号产地相似度序号名称编号产地相似度水栀子江西 水栀子安徽宣州 水栀子湖南 水栀子江西 水栀子湖南 水栀子江西 水栀子湖南 水栀子江西 水栀子广西 水栀子湖南 水栀子安徽宣州 水栀子云南 水栀子江西 水栀子湖北 水栀子广西 水栀子广西 水栀子广西 水栀子福建 水栀子湖南 水栀子广西 水栀子湖南 水栀子广西 水栀子广西 水栀子安徽郎溪 水栀子安徽郎溪 水栀子安徽宣州 水栀子安徽广德 栀子四川 水栀子安徽宣州 栀子四川 水栀子安徽宣州 栀子江西 水栀子安徽宣州 栀子湖南 水栀子安徽宣州 栀子江西 水栀子湖南 栀子江西 水栀子江西 栀子湖南 水栀子江西 栀子广西 水栀子安徽广德 栀子江西 水栀子安徽广德 栀子江西 水栀子安徽广德 栀子山西 水栀子安徽宣州 栀子浙江 水栀子安徽宣州 栀子河南 水栀子安徽宣州 栀子湖南 水栀子安徽郎溪 栀子浙江 水栀子安徽郎溪 栀子江西 水栀子安徽郎溪 栀子江西 水栀子安徽郎溪 栀子江西 水栀子安徽郎溪 栀子江西 水栀子安徽宣州 栀子江西 水栀子安徽郎溪 栀子江西 水栀子安徽郎溪 方法与结果 对照品溶液制备取栀子苷、西红花苷、西红花苷、绿原酸、京尼平苷酸、京尼平龙胆双糖苷和山栀子苷 对照品适量，加 甲醇制成每 分别含 、和 的溶液，即得 供试品溶液制备取本品粉末 ，精密称定，放置三角瓶中，精密加 甲醇 ，称定质量，超声提取 成都大学学报（自然科学版）第 卷（功率 ，频率 ），取出，放冷，用 甲醇补足减失的质量，摇匀，溶液过 的微孔滤膜，取续滤液，即得 色谱条件液相色谱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（，）以乙腈（）甲酸水溶液（）为流动相，按梯度洗脱 洗脱程序为：，；，；，；，；，；，；，；，流速 ；进样量 ；柱温 ；按时间变换检测波长，为 ，为 理论板数按西红花苷计算应不低于 质谱条件：电喷雾离子源（），离子源毛细管电压负离子，追孔电压，碰撞能量 ，脱溶剂温度 ，源温 ，脱溶剂气流速 ，质量数范围 ，数据采集为 模式 色谱条件优化 流动相筛选相同条件下分别比较了不同梯度的乙腈 甲酸系统，最后确定流动相乙腈（）甲酸水溶液（）梯度洗脱 洗脱程序为：，；，；，；，；，；，；，；，的条件分离度最佳 波长筛选选择栀子苷最大吸收波长 和西红花苷 最大吸收波长 进行比较，为了能比较全面地表征水栀子药材中环烯醚萜类和西红花苷类成分，确定采取变波长的方法，即检测波长：为 ，为 柱温筛选在同一条件下，分别比较了不同柱温（、和）色谱图的主要色谱峰分离度，确定柱温为 时最佳 流速比较在同一条件下，分别比较了不同流速（.、和 ）色谱图的主要色谱峰分离度，确定流速为 时最佳 供试液制备方法考察 提取方式选择在相同条件下，提取方式分别比较了超声提取与回流提取、超声 次与超声 次，按栀子苷、西红花苷和西红花苷等 个主要特征峰计算峰面积（）与称样量（）的比值 结果表明，超声提取与回流提取及超声次数无明显差异，考虑操作简便，确定超声提取 次 提取溶剂选择在相同条件下，分别比较了用 甲醇、甲醇、甲醇及 甲醇提取，按栀子苷、西红花苷和西红花苷等 个主要特征峰计算峰面积（）与称样量（）的比值 结果表明，甲醇的最佳，故确定 甲醇作为提取溶剂 提取体积选择在相同条件下，分别比较了用、和 的溶剂提取，按栀子苷、西红花苷和西红花苷等 个主要特征峰计算峰面积（）与称样量（）的比值 结果表明，溶剂提取效率高于 ，与 溶剂提取效率无明显差异，故确定提取溶剂的体积为 提取时间选择相同条件下，分别比较了超声、和 的提取时间，按栀子苷、西红花苷和西红花苷等 个主要特征峰计算峰面积（）与称样量（）的比值 由结果可知，超声处理 ，基本可以提取完全，故确定提取时间为 方法学考察 精密度取同一供试品溶液，连续进样 次，以第 针图谱为对照图谱，计算 针色谱图相似度，结果相似度均在 以上 再以西红花苷为参照峰，选面积相对较大的 个色谱峰，计算相对保留时间及相对峰面积的 值 结果相对保留时间 均小于.，相对峰面积 均小于 ，表明仪器精密度良好 稳定性取同一供试品溶液，分别在、和 进行测定，以 的图谱为对照图谱，计算 个 第 期 刘和平，等：基于 的水栀子药材指纹图谱建立及其与栀子药材成分差异分析时间点色谱图相似度，结果相似度均在 以上再以西红花苷为参照峰，选面积相对较大的 个色谱峰，计算相对保留时间及相对峰面积的 值 结果相对保留时间 均小于 ，相对峰面积 均小于 ，表明供试品溶液在 内稳定 重复性取同一样本粉末，按“”项下方法平行制备 份样品溶液，按“”方法测定 以第 份样品的图谱为对照图谱，计算 个平行样品色谱图相似度，结果相似度均在 以上 再以西红花苷为参照峰，选面积相对较大的 个色谱峰，计算相对保留时间及相对峰面积的 值，结果相对保留时间 均 小 于 ，相 对 峰 面 积 均 小 于.，表明方法重复性较好 样品测定与共有模式建立取 批样本按“”项下方法制备供试品溶液，并按“”项下色谱条件进行测定 将得到的 图谱数据导入相似度评价系统（专业版，北京科迈恩科技有限公司），以安徽宣城市水栀子种植基地的 批样本为代表性样品，采用峰面积的夹角余弦法确定特征峰，均数法计算特征值，筛选了 个共有峰，构成了水栀子 指纹图谱共有模式（见图）各取 批水栀子和栀子供试液，按“”项下质谱条件用 进样测定，采用负离子扫描模式，对样本进行分析，得到其总离子流图，如40035030025020015010050002.5 5.0 7.510.0 12.5 15.0时间/min1234567810121314161820212324峰面积/mAU91517221911图 水栀子 指纹图谱共有模式图 所示 在指纹图谱研究工作基础上通过与标准品比对保留时间，化合物、化合物、化合物、化合物、化合物、化合物 和化合物 分别鉴定为京尼平苷酸、山栀子苷、绿原酸、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、西红花苷和西红花苷 在暨南大学药学院周光雄教授课题组前期化学成分研究工作基础上，通过与二级质谱高分辨分子量和质谱裂解信息，化合物、化合物、化合物、化合物、化合物、化合物 和化合物 分别鉴定为、反香豆酰基京尼平龙胆二糖苷、，二咖啡酰基（羟基甲基戊二酰基）奎宁酸、阿魏酰基京尼平龙胆二糖苷、反式肉桂酰京尼平龙胆二糖苷和西红花苷 水栀子药材 指纹图谱总共有 个共有色谱峰，经 方法鉴定了其中 个色谱峰的化合物结构，其余 个化合物暂不能鉴定具体的结构 水栀子样本特征峰信息及部分化合物解析结果见表 10002.00 4.00 6.00 8.0010.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00时间/min百分比/%1.34345.154 72.60549.182 91.88391.159 53.49345.154 75.66429.212 66.76491.212 77.24695.219 77.61725.231 28.60651.265 412.94651.264 917.25711.286 919.38471.346 926.16333.227 421.51248.973 022.19311.167 51:TCF MS ES-BPI1.64e565-120171102163.19413.135 4图 水栀子负离子模式总离子流图成都大学学报（自然科学版）第 卷 表 水栀子样本特征峰与 化合物解析结果峰号相对峰面积 化合物鉴定名称分子式 号或参考文献 京尼平苷酸 对照品：山栀子苷 对照品：文献化合物 绿原酸 对照品：京尼平龙胆双糖苷 对照品：栀子苷 对照品：文献化合物 反香豆酰基京尼平龙胆二糖苷 文献化合物 ，二咖啡酰基奎宁酸 文献化合物 阿魏酰基京尼平龙胆二糖苷 文献化合物 西红花苷 对照品：西红花苷 对照品：反式肉桂酰京尼平龙胆二糖苷 文献化合物 西红花苷 文献化合物 相似度评价以安徽宣城市水栀子种植基地 批样本建立的共有模式，计算不同产地水栀子药材及栀子药材的相似度，相似度计算结果见表 结果安徽宣城市水栀子种植基地的 批样本相似度均在 以上，表明安徽宣城市水栀子种植基地不同种植片区和不同年份的 批样品所含的主要成分组分和比例均较为一致，样品各批次间质量较为均一；江西、广西和河南等不同产地水栀子药材的相似度也基本在 以上，表明不同省份种植的水栀子药材所含的主要指标性成分无明显差异；批栀子样本的相似度，批在 以上，其余 批相似度在 .之间，表明栀子药材与水栀子药材所含的主要成分组分和比例也较为