基于PBP2a特异性识别的...测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌_曹宇.pdf

免疫学杂志2023年3月第39卷第3期IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.39No.3 Mar.2023 论著 文章编号1000-8861（2023）03-0270-07；DOI10.13431/ki.immunol.j.20230035基于PBP2a特异性识别的电化学免疫传感器检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌曹宇，段浩，张珊珊，李郭成，李海波*，刘明*，高英英*摘要目的 构建一种高性能的电化学免疫传感器用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）检测。方法 制备MWCNT-PDA-AuNPs纳米复合物修饰至金电极表面，将MRSA标志蛋白PBP2a的抗体连接于纳米复合物表面，用牛血清白蛋白（BSA）封闭非特异性位点，得到一种检测MRSA的电化学免疫传感器。通过对传感器构建过程关键因素的考察确定最优条件，考察其线性范围及检出限，最后对传感器性能进行评价。结果 通过CV、EIS表征分析确定传感器的成功构建；明确最优构建条件为：MWCNT-PDA AuNPs混合比例为1 2，材料干燥温度为37，抗体孵育时间为1 h，样本孵育时间为30 min；MRSA在20 CFU/ml2.0 107CFU/ml范围内浓度对数值与DPV峰电流值呈良好的线性关系，回归方程为I(A)=-6.72lgC+84.26(R2=0.987 8)，检出限为1 CFU/ml；传感器不易被杂质蛋白干扰，其对低、中、高浓度MRSA重复测定结果RSD分别为4.18%、3.59%、4.38%（n=8），保存20 d内，传感器电信号不低于初始的92%；传感器对低、中、高浓度MRSA样本检测回收率与平板计数法基本一致。结论 该电化学免疫传感器构建简便，检测迅速、准确，灵敏度高，具有良好的特异性、重复性和稳定性，可以作为MRSA临床检测的备选方法。关键词 电化学免疫传感器；MRSA；PBP2a；MWCNT-PDA-AuNPs中图分类号 R446.61文献标识码 AElectrochemical immunosensor based on PBP2a specific recognitionfor MRSA detectionCAO Yu1,3,DUAN Hao1,ZHANG Shanshan1,LI Guocheng2,LI Haibo2,*,LIU Ming3,*,GAO Yingying1,*1.College of Clinical Medicine,Jiamusi University,Jiamusi 154007,China;2.Department of Microbiology andBiochemical Pharmacy,Faculty of Pharmacy and Medical Laboratory,Army Medical University,Chongqing 400038,China;3.Department of Pharmaceutical Analysis,Faculty of Pharmacy and Medical Laboratory,Army MedicalUniversity,Chongqing 400038,China*Corresponding Authors:LI Haibo,E-mail:;LIU Ming,E-mail:;GAOYingying,E-mail:AbstractThis study was designed to constructed a high performance electrochemical immunosensor for thedetection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA).The nanocomposite of MWCNT-PDA-AuNPs wasprepared and modified to the surface of gold electrode;the antibody of MRSA marker PBP2a was linked to thesurface of nanocomposite electrode,and the non-specific site was blocked with bovine serum albumin acid(BSA),then the electrochemical immunosensor for detectingMRSA was developed.The optimal condition,linearrange and detection limit of the electrochemical sensorwere determined by investigating the key factors in theconstruction process,and the performance of the sensorwas evaluated.The construction of the sensor wasconfirmed by the analysis of CV and EIS.The optimalconstruction conditions were determined as follows:theratio of MWCNT-PDA AuNps was 1 2;the drying基金项目：国防基础科研计划（JCKY2021204B145）；国家自然科学基金面上项目（32270988）作者单位：154007，佳木斯大学临床医学院（曹 宇，段 浩,张珊珊，高英英）；400038重庆，陆军军医大学药学与检验医学系微生物与生化药学教研室（李郭成,李海波），药物分析学教研室（曹 宇，刘 明）*通信作者：高英英，E-mail:；刘明，E-mail:；李海波，E-mail:270免疫学杂志2023年3月第39卷第3期IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.39No.3 Mar.2023金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,SA）是一种革兰阳性菌，可引起多种感染，对-内酰胺类抗生素较敏感。由于抗生素的滥用，1960年出现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA），目前已成为全球医院、社区感染的重要病原体，耐药性强，致死率高1。及时准确的临床早期诊断可以有效缓解MRSA引起的急重症感染，降低病患的死亡率2。电化学免疫传感器是近年来发展迅速的一种检测技术，同时具备电化学分析的高灵敏性与免疫反应的高特异性，还具备检测设备成本低，操作简便快速等优势3。本研究以MRSA特有的青霉素素结合蛋白2a（penicillin binding protein 2a，PBP2a）作为待测抗原，设计构建了检测MRSA的电化学免疫传感器，并对该传感器的性能进行考察评价。1材料与方法1.1仪 器 与 试 剂电 化 学 工 作 站(瑞 士 万 通PGSTAT302N)；全波长酶标仪(SPECTRA 190)；紫外分光光度仪(HITACHI U-3900)；电镜金电极（天津艾达恒晟科技发展有限公司，DAu130）；铂电极；甘汞电 极。细 胞 破 碎 仪(SCIENTZ-D)；四 氯 金 酸（SIGMA）；多壁碳纳米管（南京先丰纳米材料科技有限公司）；PBP2a 抗体（RayBio 130-10073）；OVA（SIGMA）；酪蛋白（SIGMA）；盐酸多巴胺（上海麦克林生化科技有限公司）；牛血清蛋白（北京索莱宝科技有限公司）；其它试剂均为分析纯；实验用水均为超纯水，由四川优普超纯水机制备；USA300、MRSA252、ATCC25923标准菌株均由陆军军医大学微生物与生化药学教研室提供。1.2待测样本制备取冻存菌株室温下复苏，采用三区划线法涂于MHB平板，37 培养12 h。挑取单菌落于20 ml MHB液体培养基，37，220 r/min，振摇培养12 h，进行一次活化。吸取一活菌液200 l，加入20 ml MHB中于37、220 r/min振摇培养6 h二次活化。将二活菌液5 000 r/min 离心30 min，以0.01 mol/L PBS重悬、调节至OD600 nm值为1，此时的菌液浓度为2 109CFU/ml。使用超声细胞破碎仪将重悬菌液超声破壁，获得待测样本，-20 保存。1.3PBP2a抗体活性检测按照1.2方法分别处理MRSA USA300、MRSA252与阴性对照甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌ATCC25923，通过酶联免疫吸附实验（ELISA）检测3种样本与所购PBP2a抗体的结合情况；利用过氧化物酶（HRP）与底物TMB显色，对比上述3组样本与PBS溶剂对照组在450 nm波长下吸光度，验证PBP2a抗体对MRSA的特异选择性，选择结合较强的MRSA样本以梯度稀释法分别测定吸光度，确定检测限。1.4MWCNT-PDA-AuNPs纳米复合物的制备取2.5 ml 1%的柠檬酸三钠水溶液，迅速加入0.01%的氯金酸（HAuCl4）溶液中，加热搅拌至溶液变成红色，冷却后得到金纳米（AuNPs）溶液4。称取50 mg多壁碳纳米管（multi-walled carbonnanotube,MWCNT），超声 30 min 使之分散于 30 ml无水乙醇中，形成均匀的悬浊液，然后加入 20 mlTris 缓冲液（pH8.5）。称取50 mg 盐酸多巴胺（PDA）加入混合液中，快速搅拌10 min，于室温慢速搅拌反应24 h。将反应后的混合液以13 000 r/min离心temperature was 37 C;the incubation time of antibody was 1 h;and the incubation time of sample was 30 min.There was a good linear relationship between the logarithm of MRSA concentration and the peak current of DPV inthe range of 20 CFU/ml-2.0107CFU/ml,the regression equation was I(A)=-6.72lgC+84.26(R2=0.9878),andthe detection limit was 1 CFU/ml.The sensor has strong anti-interference ability to the impurity protein,and theRSD of repeated determination results for low,medium and high concentration MRSA were 4.18%,3.59%and4.38%,respectively(n=8).The sensor electrical signal is no less than 92%of the initial value within 20 days ofstorage.The recovery rates of low,medium and high concentration MRSA samples detected by the sensor werebasically consistent with that of plate counting method.In conclusion,the constructed electrochemicalimmunosensor has the advantages of simple construction,rapid,accurate,high sensitivity,good specificity