浒苔和石莼对模拟酸雨胁迫的生理生化响应_杜响.pdf

核 农 学 报 2023，37（5）：10671075Journal of Nuclear Agricultural Sciences浒苔和石莼对模拟酸雨胁迫的生理生化响应杜响 陈海敏 秦欣 许万涛 骆其君*（宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315832）摘要：为研究常见绿藻对模拟酸雨胁迫的生理生化响应及其抗性，以1种浒苔、3种石莼为试验材料，设置5个pH水平，对其最大光化学量子产量（Fv/Fm）、相对电导率、可溶性蛋白和可溶性糖含量及抗氧化酶活性等生理指标进行测定。结果表明，模拟酸雨抑制了最大光化学量子产量，且抑制幅度随酸度和处理时间的增加而增大，pH值3.5的模拟酸雨处理30 min，石莼的Fv/Fm是浒苔的2.8倍以上；相对电导率与模拟酸雨的酸度及处理时间成正比，且发生不同程度的质壁分离；pH值4.5的模拟酸雨降低了藻体中叶绿素a、类胡萝卜素和可溶性糖含量，浒苔的降幅明显高于石莼，而酸雨处理下藻体中可溶性蛋白含量有所增加，且随着时间延长愈加显著；pH值4.5的模拟酸雨抑制了藻体中过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性，但提高了过氧化物酶活性，且处理时间与过氧化物酶活性呈正相关，与超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性呈负相关。研究认为pH值4.5能作为模拟酸雨胁迫的常见绿藻生理生化试验条件，4种绿藻对模拟酸雨具有响应差异。相比于浒苔，石莼对模拟酸雨具有更好的耐受性。本研究结果为潮间带大型海藻的生态分布特征及潜在的种群变化趋势研究提供了理论基础。关键词：浒苔；石莼；模拟酸雨；生理响应DOI：10.11869/j.issn.1000-8551.2023.05.1067酸雨作为一个全球性的环境问题，近几十年随着化石燃料的使用而变得愈加严重1-2。同欧洲和北美一样，由于化石燃料大量消耗，我国已成为世界上受酸雨影响的重灾区之一3。在我国南方，最易受酸雨影响的地区遭受了pH5的酸雨污染4-5。特别是浙江省宁波和金华市曾受到大量酸雨入侵，雨水pH值分别低于4.74和4.12，尤其是象山县，2021年雨水的pH值达到了3.986。酸雨可直接破坏植物细胞膜，使植物的代谢功能受到抑制，进而影响植物形态结构7。生活在潮间带的大型海藻，由于潮汐的每日涨落，周期性的在涨潮时淹没在海水中，在退潮时暴露在空气中。当潮间带大型海藻于低潮期暴露在空气中时，经常会直接遭受pH值为3.246.56的酸雨胁迫，而且酸雨胁迫往往持续数小时8。研究表明，模拟酸雨不仅导致冬青细胞膜透性增加9、茶树（Camellia sinensis）幼苗叶绿素a和类胡萝卜素含量减少 10，而且使夏枯草（Prunella vulgaris）超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性呈现先上升后下降趋势11；pH值4和5的模拟酸雨处理会使坛紫菜（Neoporphyra haitanensis）光合作用和呼吸作用速率下降，导致坛紫菜叶状体的死亡12；pH值4.4的模拟酸雨显著抑制了裂片石莼（Ulva fasciata）的最大光化学量子产量（maximal photochemical quantum yield of PS，Fv/Fm）、暗呼吸及光合放氧速率13。短期酸雨引起的低pH值海水导致大型海藻种类减少，进而导致珊瑚藻属（Corallina）物种泛滥8；频发的酸雨甚至可能是马尾藻床衰退的原因之一14。可见，酸雨对海洋生态系统产生了不可忽略的影响。经典的绿藻是按照形态、结构进行分类，浒苔为单层细胞组成的细长中空管状，如浒苔（Enteromorpha prolifera）、肠浒苔（E.intestinalis）；石莼为双层细胞组成的片状，如石莼（Ulva lactuca）、蛎菜（U.conglobata）15。在中国海藻志中也采用该分类及命名16。Hayden等17依据系统发育进化树中Enteromorpha与Ulva相互交叉分布，而合并为一属Ulva。酸雨胁迫对潮间带大型海藻形态变化、生理特性及存活影响等的研究鲜见报道。且与红藻、褐藻相比，近海绿藻的种类及生物量在逐渐增加，且更为常见。因此，本研究以潮间带常见绿藻为试验材料，研究不同pH值的模拟酸雨对潮间带常见绿文章编号：1000-8551（2023）05-1067-09收稿日期：2022-06-20 接受日期：2022-09-05基金项目：现代农业产业技术体系专项基金（CARS-50），南麂列岛国家海洋自然保护区管理局项目（H202200074）作者简介：杜响，男，主要从事藻类生理生化研究。E-mail：*通讯作者：骆其君，男，教授，主要从事海藻栽培研究。E-mail：1067核农学报37 卷 藻光合作用的影响，同时测定其光合色素、可溶性蛋白和可溶性糖含量及抗氧化酶活性，探讨潮间带常见绿藻对酸雨的生理生化响应，以期为研究潮间带大型海藻受环境胁迫的影响及其群落变化提供参考。1材料与方法1.1试验材料浒苔（E.prolifera）、石莼（U.lactuca）、长石莼（U.stenophylla）、蛎菜（U.conglobata）于 2021 年 2 月至2022年5月采自浙江省东极岛（122.6E，30.1N）与南麂列岛（121.3E，27.3N）。采回实验室后，选取大小和形态较一致的藻体，用灭菌海水反复冲洗，去除附生杂藻，在光照培养箱中进行培养，培养温度为20 C，光照强度为100 molm-2s-1，光照周期为12 h光照/12 h黑暗。每日更换培养海水。1.2试验仪器GXZ 型 智 能 光 照 培 养 箱，宁 波 江 南 仪 器 厂；WATER-PAM 叶绿素荧光仪，德国 Walz 公司；Nikon Eclipse Ti 倒置荧光显微镜，尼康仪器（上海）有限公司；3001酶标仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；1-16K离心机，德国Sigma公司；PHS-3E型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；FiveEasy Plus FE38电导率仪，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。1.3试验设计根据浙江省自然降雨记录18，将硫酸与硝酸按体积比配制成母液，并用蒸馏水将母液稀释成酸性水溶液，得到pH值分别为6.3、5.6、4.5、4.0和3.5的模拟酸雨19。选择状态良好的绿藻，用滤纸吸干表面水分后，放入绿藻与模拟酸雨质量比为1 100的培养皿中分别处理5、15、30、60、120、240、360 min。以自然海水（盐度25，pH值8.1）作为对照，试验设置3组重复，培养温度为20 C，光照强度为100 molm-2s-1。根据叶绿素荧光参数及形态观察的结果，选择pH值 4.5 的模拟酸雨胁迫进行浒苔与石莼的可溶性蛋白、可溶性糖含量及抗氧化酶活性等生理响应试验。1.4生理生化指标测定及形态观察1.4.1叶绿素荧光参数测定暗处理15 min后，使用WATER-PAM 叶绿素荧光仪测定叶绿素荧光诱导曲线，记录光系统（photosystem，PS）的Fv/Fm值。1.4.2相对电导率、质壁分离率测定及形态学观察利用Nikon Eclipse Ti倒置荧光显微镜观察模拟酸雨处理后绿藻细胞形态变化并拍照；参照郝再彬等20的方法，用FiveEasy Plus FE38电导率仪测定电导率。1.4.3色素的提取及测定参考Moran等21的方法并稍作改进。称取模拟酸雨处理后的藻体0.1 g（鲜重）用10 mL无水甲醇4 萃取24 h，提取液5 000 rmin-1离心10 min后，取上清于酶标仪上进行检测，参比液为提取剂空白溶液。根据公式（1）22、公式（2）23计算叶绿素a（chlorophyll a，Chl a）与类胡萝卜素（carotenoids，Car）的含量。Chl a(mgL-1)=16.29(A665A750)8.54(A652A750)（1）Car(mgL-1)=7.6(A480 A750)1.49 (A510 A750)（2）式中，A750、A665、A652、A510、A480分别为波长750、665、652、510、480 nm处的吸光度，最后根据藻体及甲醇的用量计算出Chl a与Car的含量（mgg-1）。1.4.4可溶性蛋白和可溶性糖含量的测定可溶性蛋白和可溶性糖含量分别采用南京建成生物工程研究所蛋白检测试剂盒（A045-2）考马斯亮蓝法、植物可溶性糖检测试剂盒蒽酮比色法测定24。1.4.5抗氧化酶活性的测定抗氧化酶活性均采用生物试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定。其中，SOD活性利用A001-3-2总超氧化物歧化酶测定试剂盒进行测定；过氧化物酶（peroxidase，POD）活性利用A084-3-1过氧化物酶测定试剂盒进行测定；过氧化氢酶（catalase，CAT）活性利用A-007-1-1过氧化氢酶测定试剂盒进行测定25。1.5数据处理使用 Microsoft Excel 2019 整理数据，利用 SPSS 26.0 软件进行单因素 ANOVA 分析，采用 Origin 2018软件绘图。2结果与分析2.1绿藻叶绿素荧光参数对不同 pH值模拟酸雨的响应由图1可知，随着模拟酸雨pH值降低及处理时间延长，4种绿藻Fv/Fm总体均呈下降趋势。与对照组相比，pH值6.3、pH值5.6的模拟酸雨处理4种绿藻，仅pH值5.6的模拟酸雨处理长石莼6 h及处理浒苔4 h有极显著差异（P0.05）；pH值3.5的模拟酸雨处理1 h，石莼长石莼，其余绿藻Fv/Fm几乎趋近于0。由图2可知，pH值4.5的模拟酸雨处理过程中，石莼相较于其他绿藻表现出良好的耐酸性，但浒苔和长10685 期浒苔和石莼对模拟酸雨胁迫的生理生化响应石莼间无显著差异（P0.05）。酸雨处理6 h，石莼、蛎菜、长石莼、浒苔的Fv/Fm依次为0.556、0.471、0.321、0.285，其中，浒苔和蛎菜、石莼间均具有极显著差异（P0.01）。2.2绿藻相对电导率、质壁分离率及藻体形态对不同pH值的模拟酸雨的响应浒苔相对电导率与酸度呈正相关，pH值越低其相对电导率越大，且相对电导率随着胁迫时间的增加而变大。不同pH值的模拟酸雨处理浒苔，其相对电导率均高于对照组，pH值3.5的模拟酸雨处理6 h的相对电导率最大，为98.3%，和对照组相比差异极显著（P长石莼浒苔蛎菜，与对照组相比差异显著（P0.05）（表1）。由表2可知，酸雨处理6 h，除长石莼外，其余绿藻Car5306012024036000.20.40.60.8AbAabAaAaAabBbAaAaAaDdCcBbAabAaDdCcBbAaAaAaAaAaDdCcBbAabAaAaCcBbAaAabAaB CK pH6.3 pH5.6 pH4.5 pH4.0 pH3.5最大光化学量子产量Fv/FmA5306012024036000.20.40.60.8AaAaAaAaAaCcBbAaAaAaCdBcAbAabAaAaCcBbAaAaAaAaBbCcAaAaAaAaBcAbAabAabAaAabAa5306012024036000.20.40.60.8AabAabAabAabAaCcBbAaAaCcBbAaAaAaDdCcBbAaAaAaCdBcAabAbAabAaCdBcAaAbAabAabAaDC处理时间 Treatment time/min5306012024036000.20.40.60.8AabAaAabAabAbAabAabBbAaAaAaCcBbAaAaAaBbAaAaAaAaCdBcAbAabAaAabBbCcAabAaAa最大光化学量子产量Fv/Fm处理时间 Treatment time/min注：A：浒苔；B：石莼；C：长石莼；D：蛎菜；不同小写字母表示同一时期不同pH模拟酸雨胁迫之间差异显著（P0.05），不同大写字母表示同一时期不同pH模拟酸雨胁迫之间差异极显著（P0.05），与对照组相比，长石莼的Car降幅依次小于蛎菜、石莼、浒苔。2.4绿藻可溶性蛋白含量和可溶性糖含量对 pH值 4.5的模拟酸雨胁迫的响应由图4可知，与对照组相比，pH值4.5的