基于CadR的镉生物传感器的构建与优化_蔡叶申.pdf

基于 CadR 的镉生物传感器的构建与优化蔡叶申1,2，张天一3，鲍凌志3，马洁3，陈少鹏2,3*1.中国科学院合肥物质科学研究院2.中国科学技术大学3.皖南医学院公共卫生学院摘要以镉调控蛋白（cadmium resistance protein,CadR）为检测元件、绿色荧光蛋白为报告元件构建镉离子细菌生物传感器检测水体样品中的重金属镉，通过单因素试验和正交试验对检测条件进行优化以提升传感器的相对荧光强度，基于最优组合使用所构建的镉细菌生物传感器对加标长江水样进行检测。结果表明：所构建的重金属镉细菌生物传感器在 0200 g/L 浓度范围内对镉的荧光响应符合剂量依赖效应；单因素试验结果表明，温度、pH、诱导时间以及阳离子对镉生物传感器的灵敏度有显著影响，而通过改变不同阴离子配体对检测结果并未产生显著影响；正交试验优化结果显示，镉细菌生物传感器的最优检测条件组合为：温度为 37，pH 为 7，诱导时间为 120 min，添加终浓度为 50 g/L 的 Mg2+，在此条件下传感器响应镉的相对荧光强度相较于优化前增强了 1.6 倍；使用该传感器对加标长江水样检测结果显示，其对于 0500 g/L 的环境水样中的镉具有较好的检测能力，荧光响应最大值达到背景值的 20 倍。关键词重金属；镉；细菌生物传感器；镉调控蛋白；性能优化中图分类号：Q81 文章编号：1674-991X（2023）02-0873-08doi：10.12153/j.issn.1674-991X.20220230Construction and optimization of cadmium-responsive bacterialbiosensor based on CadRCAI Yeshen1,2,ZHANG Tianyi3,BAO Lingzhi3,MA Jie3,CHEN Shaopeng2,3*1.Hefei Institutes of Physical Science,Chinese Academy of Sciences2.University of Science and Technology of China3.School of Public Health,Wannan Medical CollegeAbstractUsing cadmium responsive protein(CadR)as detection element and green fluorescent protein as reportelement,a cadmium-responsive bacterial biosensor was constructed to detect heavy metal cadmium in watersamples.Single factor experiment and orthogonal test for detection condition optimization were applied to improvethe relative fluorescence intensity of the biosensor.Finally,the spiked Yangtze River water samples was detectedwith the constructed cadmium-responsive bacterial biosensor based on the given optimal combination.The resultsshowed that the fluorescence response of the biosensor to cadmium in the concentration range of 0-200 g/Lconformed to the dose-dependent effect.The single-factor test showed that temperature,pH,induction time andcations had significant effects on the sensitivity of cadmium-responsive biosensor,while different anion ligands hadno significant effect on the detection results.The orthogonal test showed that the optimal detection conditions forcadmium-responsive bacteria biosensor were as follows:temperature 37,pH 7,induction time 120 min,andadding Mg2+with final concentration of 50 g/L.The verifying experiment indicated that under the optimalcombination condition,the fluorescence response of the biosensor to the same concentration of cadmium increasedby 1.6 times.The detection results of the spiked Yangtze River water samples by the sensors showed their highperformance in detecting cadmium in 0-500 g/L environmental water samples,and the maximum fluorescenceoutput reached 20 times of the background.Key wordsheavy metal;cadmium;bacterial biosensor;cadmium-responsive protein;performance optimization 收稿日期：2022-03-11基金项目：安徽省重点研究与开发计划项目（E06CSG635A1），安徽省高校自然科学研究项目（KJ2020A0598）作者简介：蔡叶申(1996)，男，硕士研究生，主要从事合成生物学、环境污染物生物传感器研究，EasonC*责任作者：陈少鹏（1971），男，研究员，主要从事环境毒理与生物检测、生物大分子定向进化研究， Vol.13，No.2环境工程技术学报第 13 卷，第 2 期Mar.，2023Journal of Environmental Engineering Technology2023 年 3 月蔡叶申，张天一，鲍凌志，等.基于 CadR 的镉生物传感器的构建与优化 J.环境工程技术学报，2023，13（2）：873-880.CAI Y S,ZHANG T Y,BAO L Z,et al.Construction and optimization of cadmium-responsive bacterial biosensor based on CadRJ.Journal ofEnvironmental Engineering Technology，2023，13（2）：873-880.重金属污染作为导致突发公共卫生污染事件的重要因素而被广泛关注。镉作为主要环境重金属污染物之一，对人体健康具有重大威胁，饮用水中镉浓度限制标准为 5 g/L。土壤及饮用水中镉浓度检测对预防由工农业“三废”排放所导致的镉污染具有重要意义1-3。传统的镉检测主要依赖于质谱法，需要大型仪器及专业技术的支持，且成本昂贵，难以满足实际环境样本快速便捷的检测需求4-5。细菌生物传感器具有检测时间短、操作简便及成本低廉等优点，在重金属污染物检测方面拥有巨大的潜力6。在环境重金属污染物的检测过程中，生物利用度是评价其毒性的一项重要指标，其代表分析物对生物群的可用性，以生物体作为检测载体的细菌生物传感器能够反映环境中化学物质的生物利用度7。环境中重金属的存在会对微生物产生毒性作用，微生物对重金属的排毒作用一方面是通过氧化还原、生物矿化和甲基化等方式降低重金属毒性，另一方面是通过重金属的响应-排出机制将重金属排出胞外8-9。细菌生物传感器一般由响应元件及报告元件构成，特异性识别重金属的响应元件（一般为金属结合蛋白）在识别到外界环境中的重金属离子后，与报告模块中其特异性结合的启动子结合或脱落，启动下游报告基因的表达，通过检测报告基因的表达便可实现整个通路的信号检测，即报告基因信号的表达量反映了环境中重金属离子的浓度。近年来，基于镉调控蛋白（CadR）所构建的镉离子细菌生物传感器已经被应用于检测饮用水中镉浓度10-12。然而，目前所构建的镉离子细菌生物传感器在实际环境样品检测中仍然存在灵敏度、特异性和抗干扰能力较低的弊病，这限制了生物传感器在实际环境样品检测中的应用13。微生物全细胞生物传感器以细菌作为底盘细胞，其对污染物响应的灵敏度受到诸多环境因素的影响，如温度、pH、无机物及有机物、有毒物质含量、样品介质类型等13-15。因具有遗传背景清楚且易于进行基因表达操作的特点，目前绝大多数所构建的污染物检测的细菌生物传感器都以大肠杆菌作为底盘细胞16-18。以细菌作为传感器载体进行的污染物检测往往依赖于稳定的诱导培养体系，即除了将细菌暴露于特定浓度的污染物液体环境中外，还需要提供适合细菌生长的培养基组分。诱导体系的复杂程度会对传感器的灵敏度产生一定的影响，所以诱导体系的成分简单且明确对评价传感器检测灵敏度具有重要意义19。对细菌生物传感器性能的优化方式主要集中在信号放大12,20-21、传感元件的进化22-23等方面。这些手段多从基因层面上进行传感器元件的改造，对其性能的提升具有显著效果，但基因操作的复杂程度以及未知性很难预估，且处于实验室环境下的改造结果不一定能够完全满足实际环境的应用要求。从基础诱导条件出发，通过探究诱导体系的理化条件对细菌生物传感器响应分析物所产生荧光的影响，能够有效反映各种不同理化因素对传感器检测存在的影响，再通过正交试验将各影响因素进行组合，探究不同组合对传感器检测结果的影响便可以得到最适合传感器检测的最优组合条件，这对于提升传感器的检测性能同样具有可行性。目前关于生物传感器的诱导条件优化报道较少，因此笔者基于 CadR 构建能够响应镉的细菌生物传感器，通过设置不同温度、pH、诱导时间以及离子环境条件来探究不同单因素对传感器响应重金属镉的影响，利用正交试验优化检测条件，并最终将该传感器应用于实际环境样品的检测中。1材料与方法 1.1试验材料质粒与菌株：CadR 表达载体使用的是 pSB1k3，为 实 验 室 自 有 高 拷 贝 质 粒，携 带 有 卡 那 霉 素（Kanamycin，简称 Kana）抗性基因用于抗性筛选。宿主细菌为大肠杆菌（Escherichia coli）Jude I，为实验室自有菌株。试剂：酵母提取物、胰蛋白胨（OXOID 生物公司）；卡那霉素、琼脂粉（生工生物工程有限公司）；氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、高锰酸钾、碳酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硝酸、氢氧化钠（上海国药集团化学试剂有限公司）；镉标准溶液、铜标准溶液、锌标准溶液（国家标准物质中心）。实际水样：采自安徽省芜湖市镜湖区长江与青弋江交汇处（11821E，3119N）。仪器设备：艾本德微量移液器（200 L、1 mL，德国）、精宏恒温摇床（ZQLY-80V 型，上海）、紫外分光光度计（UV-5100 型，上海）、艾科浦纯水仪（AWL-1002-H 型，美国）、华泰立式高压灭菌锅（LX-B75L型，合肥）、超净工作台（SW-CJ-ZD 型，苏州）、华志电子分析天平（HZK-FA210S